SOX10,EDNRB在人胚胎肠神经系统发育中的表达

摘要

目的：
　　 先天性巨结肠(hirschsprung's disease，HD)又称肠管无神经节细胞症(aganglionosis)，是一种常见的肠道神经发育畸形，发病率为1/5000。它是由于肠壁黏膜下层神经丛和肌间神经丛中神经节细胞缺失导致的先天性肠道运动障碍性疾病，肠神经系统发育与神经嵴细胞迁移、分化异常密切相关，因此认为HD是一种神经嵴疾病。
　　 肠神经系统(enteric nervous system，ENS)是由起源于神经嵴细胞(neural crestcell,NCC)的神经元和神经胶质细胞聚集而成，在胃肠道内形成相对独立的神经网络。胚胎学的研究证实，从胚胎第5周起，来源于神经嵴的神经母细胞，沿迷走神经纤维由头侧向尾侧迁移。整个移行过程，到胚胎第12周时完成。因此，无神经节细胞症是由于在胚胎第12周前发育停顿所致，停顿愈早，无神经节细胞肠段就愈长。
　　 研究表明，Sox10与EDNRB在肠神经发育过程中起关键性作用，目前关于消化道神经系统发育的研究较多为禽类和鼠类，而对人胚胎期消化道神经系统发育研究较少。因此，我们研究了胚胎第7周到第12周肠神经系统发育这一重要时期中Sox10、EDNRB的表达情况，并以神经营养因子受体(p75NTR)标记迁移的NCC，为HD提供胚胎基础性研究
　　 方法：
　　 一、标本与分组
　　 32例人类胚胎标本（来源于中国医科大学盛京医院节育门诊，并获得医院伦理委员会认可[no.2012 PS80K]）根据根据Carnegie分期及月经龄及彩超提示，分为三组（表1）。
　　 表1，分组┏━━━━━┳━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┓┃孕周数┃7-8th┃9-10th┃11-12th┃┣━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━┫┃标本数量┃10┃13┃9┃┗━━━━━┻━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┛
　　 二、实验试剂
　　 (1)表2，一抗试剂┏━━━━━━━━━┳━━━━━┳━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━┓┃Primary antibody┃ Species┃ dilution┃ Source┃┣━━━━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━┫┃ EDNRB┃ Rabbit┃1:160┃武汉博士德生物公司┃┣━━━━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━┫┃ Sox10┃ Rabbit┃1:160┃北京博奥森生物公司┃┣━━━━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━┫┃ p75NTR┃ Rabbit┃1:160┃北京博奥森生物公司┃┗━━━━━━━━━┻━━━━━┻━━━━━━━┻━━━━━━━━━━━━┛
　　 (2) SP试剂盒及DAB显色剂购自北京中杉金桥有限公司。
　　 三、实验方法
　　 将32例人胚胎标本取后肠，经脱水、石蜡包埋、连续切片，采用SP免疫组织化学方法检测Sox10，EDNRB，在各组中的分布及表达。PBS代替一抗作为阴性对照，全部切片由两位有经验的病理医师观察并诊断。胞质中出现棕黄色颗粒者为阳性，观察Sox10，EDNRB，p75NTR抗体表达情况。采用图像采集软件(NIS-ElementsF3.0)对所有标本数码照片(200x，400x)图像进行采集。
　　 结果：
　　 7-8w，Sox10、EDNRB仅在肠道浆膜层有很弱的阳性表达;9-10w，Sox10、EDNRB阳性表达增强，在肠道粘膜下层、环肌层、浆膜层都有表达;11-12w，阳性表达与9-10w相似。同一标本，前后连续两张切片，免疫组化染色显示p75NTR标记的神经嵴细胞阳性表达几乎与Sox10，EDNRB成一致性。
　　 结论：
　　 本研Sox10、EDNRB在人胚胎7-12wSox10、EDNRB在人胚胎7-12w后肠的浆膜、环肌层及粘膜下层中有表达，而7-12w为肠神经嵴迁移的重要时期，进一步提示Sox10、EDNRB参与了人肠神经系统的发育。

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