丙泊酚对LPS介导的人离体嗜中性白细胞产生ROS的影响

摘要

目的：
　　嗜中性白细胞在机体细胞免疫系统中起着十分重要的作用。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可通过激活TLR4(Toll like receptor)信号通道影响嗜中性白细胞的迁移、呼吸爆发、激活、调亡、生存和调亡。LPS活化嗜中性白细胞膜上的NADPH氧化酶产生氧自由基，主要通过MyD88依赖型途径和MyD88非依赖型途径。其中丝裂霉素激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是上述两通道的共同途径之一。丙泊酚为临床常用的静脉麻醉剂，近来发现丙泊酚还具有抗氧化作用和抗炎特性。许多研究表明丙泊酚可下调LPS介导的嗜中性白细胞TLR4表达。但丙泊酚调节嗜中性白细胞的机制并不清楚。本研究观察丙泊酚对人嗜中性白细胞MyD88以及其下游因子TRAF6，TRAF3和p38MAPK表达的影响，以期待论证丙泊酚抗炎的机制。
　　方法：
　　获得院伦理委员会和志愿者知情同意后，从10名不吸烟健康志愿者抽取外周静脉血20ml，立即置于葡聚糖沉淀(密度为1.077g/ml)的肝素化试管中，缓慢摇匀。然后离心200×g分离10min。去掉血浆层、单个核细胞层和红细胞，并用PBS洗涤3遍。离心200×g分离10min。去掉上清，反复3次。将分离的人嗜中性白细胞(5×107)置于PMI1640培养基重悬，离心洗涤。用流式细胞仪分析CD16-PE和CD66b-FITC标记的人嗜中性白细胞纯度，为99％。细胞用于以下分析:①用流式细胞仪分析LPS介导的嗜中性白细胞内活性氧的水平和丙泊酚的影响。将嗜中性白细胞(3×106 cells)置于10μM CM-H2DCFDA的无胎牛血清的培养液中30min，然后用LPS（终浓度为1μg/ml）和不同浓度的丙泊酚((10，50，100，150μM)）刺激10min。用流式细胞仪通过计算二氯二乙酸酯氧化的百分率检测ROS水平。②用Western blot法检测嗜中性白细胞MyD88、 TRAF6、TRAF3和p38MAPK表达。将嗜中性白细胞(3×106 cells)置于细胞裂解液中。用LPS（终浓度为1μg/ml）和不同浓度的丙泊酚（10，50，100，150μM）刺激10min，各组样本分别加入10％SDS-PAGE电泳分离胶中。然后转至PVDF膜上。用封闭液室温下处理细胞2hr。最后加入一抗（缓冲液含有5％ BSA，1XTBS，0.1％Tween-20;浓度比为1∶1000）4℃过夜。然后将PVDF膜洗涤2次，各5min，加入二抗（浓度1∶500）室温孵育2h。用ECL发光液进行成像。
　　结果：
　　人嗜中性白细胞(5×105 cells/well)用纯化LPS(1μg/mL)和相应浓度的丙泊酚(10，50，100，150μM)进行孵育10min，通过流式细胞仪检测产生细胞内活性氧的水平。结果发现丙泊酚呈浓度依赖性抑制LPS介导的人嗜中性白细胞活性氧的产生。丙泊酚（10μM和50μM）抑制程度分别为89.58±6.67％ or73.69±6.33％，明显低于单纯LPS组(P＜0.05)，随着浓度的增加（100μM和150μM），其抑制程度分别为65.61±4.67％ or60.0±8.50％，(P＜0.01)。人嗜中性白细胞(5×105cells/well)用纯化LPS(1μg/mL)和相应浓度的丙泊酚(10，50，100，150μM)进行孵育10min，用Western blot法检测嗜中性白细胞MyD88、 TRAF6、TRAF3和p38MAPK水平。结果发现丙泊酚呈浓度依赖性抑制LPS介导人嗜中性白细胞MyD88、TRAF6和p38MAPK磷酸化的表达，而对TRAF3磷酸化影响不大。
　　结论：
　　1.丙泊酚（10μM、50μM、100μM、150μM）可呈浓度依赖性抑制LPS介导人嗜中性白细胞产生活性氧。丙泊酚对活性氧的抑制与下调p38MAPK有关。
　　2.丙泊酚抑制活性氧产生下调p38MAPK与抑制TLR4-MyD88通路有关，而与TRAF3的表达无关。

目录

声明

摘要

英文缩略语

前言

材料与方法

一、实验材料

二、实验方法

实验结果

一、丙泊酚呈剂量依赖性抑制LPS介导嗜中性白细胞产生ROS

二、丙泊酚对LPS介导嗜中性白细胞p38MAPK磷酸化的影响

三、丙泊酚对LPS介导嗜中性白细胞MyD88表达的影响

讨论和结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 丙泊酚对人离体嗜中性白细胞TLR4通路表达的影响

致谢

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