磁共振成像兼容的铌钽合金生物相容性研究

摘要

目的：
　　自从19世纪80年代磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)应用于临床以来，发展十分迅速，目前已成为当今医学诊断中最强有力的工具之一。由于MRI检查时需要将人体置于强大的外加磁场中，当带有金属移植物的病人进行MRI检查时，磁场与金属物质之间的相互作用可能会对病人或金属装置的功能造成损害。另一方面，静磁场的均匀性和梯度磁场的线性受到金属物质的破坏和干扰造成的影像变形所形成的磁敏感性伪影(magnetic susceptibility artifact，MSA)，有可能影响对疾病的诊断。目前临床上常用的合金为不锈钢、钴基合金、钛及钛合金。不锈钢和钴基合金由于含有铁磁性元素钴和镍导致其磁化率较高，磁敏感性伪影较大;钛及钛合金的抗拉强度、刚性、延长率相对不足限制了它们在介入领域的使用。Nb-60Ta-2Zr是中科院金属研究所自主研发的一种新型的磁共振成像兼容的医用合金。Nb-60Ta-2Zr合金中主要的构成元素为铌、钽和锆，三者均为无毒性金属元素，保证了铌钽合金的生物安全性。三者均为顺磁性金属元素，因而铌钽合金的体积磁化率(214×10-6)与Ti较为接近(182×10-6)，远低于不锈钢和钴基合金，约106数量级。这一特性使得Nb-60Ta-2Zr在磁共振成像中极为兼容。从目前的实验结果来看，铌钽合金的杨氏模量为142GPa，低于316LSS(200GPa)和钴铬合金(210-240GPa)，与CP钛(110GPa)较为接近，这一特性使铌钽合金应用于骨科领域成为可能;铌钽合金的耐腐蚀性与Ti接近(排气后的0.17MNaCl下的击穿电位为9V)，明显高于316LSS(0.4-0.48V)和钴铬合金(0.87V)，这一特点使铌钽合金和钛同样适合用于人体生理环境;铌钽合金的屈服强度和抗拉强度分别为330MPa和470MPa，与316LSS(170-1100MPa和480-1350MPa)和钴铬合金(300-1500MPa和800-1800MPa)接近，但高于CP钛(280MPa和345MPa)，这使得铌钽合金具备良好的可加工性能;铌钽合金的密度(12.03g/cm3)相对于不锈钢(316LSS，7.93g/cm3)、钴基合金(L605，9.13g/cm3)和钛(4.5g/cm3)最高，因而铌钽合金的X线成像最为清晰。因此，铌钽合金作为一种新型医用合金极具应用前景，其生物相容性亟待研究。将Nb，Ta作为对照研究，为医用合金成分的选择提供实验依据。
　　实验方法：
　　1、材料制备
　　Nb-60Ta-2Zr，Ta，Nb，316LSS和L605合金5组样品经线切割成10mm×10mm×2mm，400＃-2000＃砂纸打磨，抛光至1μm。丙酮、无水酒精、75％酒精、超纯水依次清洗10min，干燥备用。
　　2、实验材料分组
　　(1)论文一:实验组:Nb-60Ta-2Zr;对照组:Ta，Nb，316LSS和L605合金。
　　(2)论文二:实验组:Nb-60Ta-2Zr;对照组:Ta，Nb，316LSS和L605合金。
　　(3)论文三:实验组:Nb-60Ta-2Zr;对照组:316LSS。
　　3、白蛋白和纤维蛋白原在Nb-60Ta-2Zr表面的吸附
　　(1)表面粗糙度
　　将制备好的样品置于激光共聚焦显微镜LEXT OLS4000(Olympus，USA)下，调整仪器参数，仪器取样长度l=0.8mm，每次测量包括5段取样长度，每次测量长度为4mm，重复3次。
　　(2)白蛋白和纤维蛋白原的吸附
　　纤维蛋白原和白蛋白的磷酸盐缓冲液(PH=7.4)稀释至0.3mg/ml和3mg/ml。将样品置于24孔板内，6个/组×5组×3次，加蛋白溶液，37℃静置孵育1h，蒸馏水清洗未粘附的蛋白，然后加5％SDS200μl，37℃过夜，超声10min，BCA试剂盒(Pierce Biotechnology，USA，＃23235)检测SDS蛋白溶液。
　　(3)X射线光电子能谱(XPS)分析
　　Nb-60Ta-2Zr样品在37℃下与全血孵育1h，依次用PBS与蒸馏水冲洗，干燥，XPS分析样品表面化学成分。采用ESCALAB250表面分析系统(Thermo VG，USA)，1486.6eV单色源Al靶X-射线源，90°离去角检测，束斑大小500μm×500μm，扫描能量50eV，能量梯度0.1eV。C1s的结合能为284.8eV。按照Shirley法去除背景。通过XPSPEAK4.1分析软件，进行XPS谱的曲线拟合以确定峰位、高度、宽度和高斯/洛伦兹比。
　　4、血液相容性
　　(1)血小板的粘附和活化
　　①血小板粘附试验:采健康新鲜人血（血常规、凝血四项在正常范围，10天内未服用抗凝剂），柠檬酸钠1∶9抗凝，75g×5min离心制得富血小板血浆，调整血小板密度至3.0×1011/l。样本置于24孔板内，3个/组×5组，与100μlPRP37℃孵育2h，PBS冲洗，2.5％戊二醛室温固定12h，梯度脱水，干燥，喷金，SEM观察。每种样本随机选取15个区域，用计算机辅助分析图像软件计算每种金属表面血小板覆盖的面积。
　　②粘附血小板乳酸脱氢酶活性:样本置于24孔板内，6个/组×5组×3次，与100μlPRP37℃静置孵育60min，PBS冲洗，100μl1％Triton-PBS透膜。60min后，Triton-PBS洗液上LDH试剂盒检测。
　　③血小板活化检测:将样本置于24孔板内，6个/组×5组×3次，加1ml全血（EDTA抗凝），37℃静置孵育1h，血样离心，ELISA试剂盒检测血清中P-选择素含量。
　　(2)凝血
　　将样本置于24孔板内，6个/组×5组×3次，采健康新鲜人血（血常规、凝血四项在正常范围，10天内未服用抗凝剂），柠檬酸钠1∶9抗凝，将样本与血清37℃静置孵育1h。全自动血凝分析仪检测PT、APTT、TT。
　　(3)溶血
　　采健康新鲜人血（血常规、凝血四项在正常范围，10天内未服用抗凝剂），柠檬酸钠1∶9抗凝，与生理盐水4∶5稀释。调整生理盐水用量，使稀释后的抗凝人血0.2ml在10ml蒸馏水中于545nm处的吸光度值为0.8±0.3。生理盐水阴性对照，蒸馏水阳性对照，实验组3个/组×5组×3次。各实验组按3cm2/ml加稀释血样，37℃恒温水浴3h。750g离心5min，分光光度计545nm检测吸光度值，带入公式计算溶血率:Hemolysis=OD(test)-OD(negative control)/OD(positivs control)-OD(negative control)×100
　　5、人脐静脉内皮细胞在Nb-60Ta-2Zr表面的粘附与增殖
　　(1)细胞培养
　　复苏后的HUVEC加入培养基;在37℃，5％CO2及饱和湿度条件下静置培养，倒置显微镜下观察细胞生长情况，隔天换液，细胞长至80％融合时，进行传代。
　　(2)材料表面细胞粘附的形态学观察
　　取1块无菌24孔板，将Nb-60Ta-2Zr和316LSS放入孔中，传代后的HUVEC细胞经0.25％胰酶消化，吹打成细胞悬液，计数板下计数，以2×104/ml的密度接种于金属样品表面，每种金属每个时间点接种3片，放入细胞培养箱中培养。于接种后6h取出，PBS冲洗，戊二醛固定12h，梯度乙醇脱水，喷金，扫描电镜下观察细胞形态。
　　(3)材料表面粘附细胞的VE-cadherin表达
　　将HUVEC分别接种在Nb-60Ta-2Zr和316LSS上3d后，用细胞刮小心的将样品表面的细胞刮下，裂解，离心。收集上清。Western blot检测VE-cadherin在两种样品表面的表达。
　　(4)材料表面细胞增殖实验
　　细胞及接种方法同5(2)，样品分别于接种后6h、1d、2d和3d取出;移入新的24孔板中，每孔加入培养液和CCK-8混合液，孵育3h后，避光条件下每孔取出溶液放入新的96孔板中，450nm波长条件下酶标仪检测OD值。
　　6、统计学分析
　　3(2)，4(1)①，4(1)②，4(1)③，4(2)，4(3)，5(3)，5(4)的结果用(x)±SD表示。使用SPSS14.0软件进行单因素方差(One way ANOVA)分析，之后，组间的多重比较采用SNK法。所有的检测数据，重复3次，p＜0.05被认为有统计学差异。
　　实验结果：
　　1、白蛋白和纤维蛋白原在Nb-60Ta-2Zr表面的吸附
　　(1)表面粗糙度
　　5种金属表面粗糙度（Ra）:Nb-60Ta-2Zr合金为132±5nm，Nb为162±2nm，Ta为136±1nm，316LSS为31±2nm，L605钴铬合金为35±1nm。
　　(2)白蛋白和纤维蛋白原的吸附
　　各实验组的白蛋白吸附量(μg/cm2):Nb-60Ta-2Zr合金为2.07±0.28，Nb为1.95±0.25，Ta为2.05±0.18，316LSS为2.3±0.24;L605钴铬合金为2.49±0.25。其中316LSS与其他各实验组比较，白蛋白吸附量无差异(p＞0.05);L605钴铬合金的白蛋白吸附量高于Nb-60Ta-2Zr合金、Nb和Ta(p＜0.05);Nb-60Ta-2Zr合金、Nb和Ta之间无差异（p＞0.05）。
　　各实验组的纤维蛋白原吸附量(μg/cm2):Nb-60Ta-2Zr合金为2.66±0.41，Nb为2.69±0.32，Ta为2.58±0.2，316LSS为3.16±0.18;L605钴铬合金为3.49±0.2。Nb-60Ta-2Zr合金、Nb和Ta之间无差异(p＞0.05);316LSS与L605钴铬合金的纤维蛋白原吸附量无差异(p＞0.05);316LSS和L605钴铬合金的吸附量明显高于Nb-60Ta-2Zr合金、Nb和Ta(p＜0.05)。
　　各实验组吸附的蛋白比(BSA/BSF)为:Ta(0.79)＞Nb-60Ta-2Zr(0.78)＞Nb和316LSS(0.73)＞L605(0.71)
　　(3)全血浸泡后样品表面XPS分析
　　样品在全血中浸泡后，检测到的表面成分主要为C，O和N，相对原子含量分别为:67.81％，13.99％和16.86％，并有少量的S，Cl，P，Ca和Mg，相对含量分别为0.50％，0.26％，0.23％，0.23％和0.13％。
　　2、血液相容性
　　(1)血小板的粘附和活化
　　①血小板粘附试验:
　　扫描电镜2000倍视野下，可见血小板在各金属样品表面的分布状态，部分区域可见血小板聚集。血小板的覆盖面积分别为(％):Nb-60Ta-2Zr合金为30.8±5.6，Nb为29.1±7.2，Ta为28.1±7.5，316LSS为44±5.1，L605钴铬合金为44.3±6.1。316LSS与L605钴铬合金之间的血小板覆盖面积没有统计学差异（p＞0.05），Nb-60Ta-2Zr合金、Nb和Ta之间没有统计学差异（p＞0.05）。而316LSS与L605的血小板覆盖面积显著大于Nb-60Ta-2Zr合金、Nb和Ta(p＜0.05)。
　　扫描电镜20000倍视野下，可见各金属样品表面的血小板呈分支样铺展，血小板之间的伪足相互接触。Nb-60Ta-2Zr合金、Nb和Ta表面血小板伪足较清晰，伪足间的铺展面积较小;316LSS与L605伪足铺展面积较大。
　　②粘附血小板乳酸脱氢酶活性:
　　5种金属表面血小板粘附量(U/l):Nb-60Ta-2Zr合金为67.5±6.9，Nb为76.2±5.8，Ta为70.9±8.8，316LSS为83±8.8，L605钴铬合金为85.6±11.2。Nb-60Ta-2Zr合金、Nb和Ta之间没有统计学差异（p＞0.05）;Nb、316LSS和L605钴铬合金之间没有统计学差异（p＞0.05）;316LSS和L605钴铬合金表面粘附的血小板数量明显高于Nb-60Ta-2Zr合金和Ta（p＜0.05)
　　③血小板活化程度
　　5种金属导致的血小板活化量为(ng/ml):Nb-60Ta-2Zr合金为42.1±2.3，Nb为45.2±2.8，Ta为42.5±1.3，316LSS为46.5±3，L605钴铬合金为48±3.3。Nb-60Ta-2Zr合金、Nb和Ta之间没有统计学差异（p＞0.05）;Nb、316LSS和L605钴铬合金之间没有统计学差异（p＞0.05）;316LSS和L605钴铬合金引起的血小板活化明显高于Nb-60Ta-2Zr合金和Ta（p＜0.05)。
　　(2)凝血
　　5种金属的凝血时间PT、APTT、TT均在正常范围之内，分别为PT:11.8-12.23s;APTT:32.07-37.2s;TT:16.97-17.5s。其中Nb-60Ta-2Zr合金和Ta的PT和APTT的时间明显长于Nb、316LSS和L605钴铬合金（p＜0.05）;而TT的时间，Nb-60Ta-2Zr合金、Nb和Ta之间没有统计学差异（p＞0.05）;Nb、316LSS和L605钴铬合金之间没有统计学差异（p＞0.05）;316LSS和L605钴铬合金的TT明显短于Nb-60Ta-2Zr合金和Ta（p＜0.05)
　　(3)溶血
　　各实验组的溶血率(％):Nb-60Ta-2Zr合金为1.38±0.26，Nb为1.44±0.12，Ta为1.38±0.10，316LSS为1.60±0.15，L605钴铬合金为1.62±0.13。均低于5％。各实验组之间没有差异（p＞0.05）。
　　3、人脐静脉内皮细胞在Nb-60Ta-2Zr表面的粘附与增殖
　　(1)材料表面细胞粘附的形态学观察
　　HUVEC接种在样品表面后，镜下呈现出细胞特征性的形态，高倍镜下可见细胞伪足，与材料贴附紧密，表面清晰生长状态良好。随着接种时间延长，镜下细胞密度增加。实验组和对照组的细胞数量和形态未见差别。
　　(2)材料表面粘附细胞的VE-cadherin表达
　　Nb-60Ta-2Zr和316LSS表面粘附细胞的VE-Cadherin相对表达量无统计学差异(p＞0.05)
　　(3)材料表面细胞增殖实验
　　随着接种时间的延长，实验组和对照组的OD值不断提高，至7d达最高。实验组和对照组的OD值无明显差异（p＞0.05）。
　　结论：
　　1、Nb-60Ta-2Zr表面吸附的白蛋白和纤维蛋白原较316LSS和L605少。Nb-60Ta-2Zr、Nb、Ta、316LSS和L605的疏水性并不一定与白蛋白和纤维蛋白原的吸附量呈正相关。白蛋白和纤维蛋白原的吸附量与5种金属材料表面自由能的极性部分关联更为密切，极性部分能量越低，白蛋白和纤维蛋白原吸附量越高。
　　2、相对于316LSS和L605，Nb-60Ta-2Zr合金、Nb和Ta血小板的粘附活化程度较低，血小板的活化程度和粘附程度与材料表面粘附的纤维蛋白原呈正相关;Nb-60Ta-2Zr合金抗凝血性能较高;几种合金的的溶血率均符合ISO标准，Nb-60Ta-2Zr的血液相容性优于316LSS和L605。
　　3、人脐静脉内皮细胞在Nb-60Ta-2Zr表面的生物学响应与316LSS相近，Nb-60Ta-2Zr对人脐静脉内皮细胞的粘附和增殖没有影响。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 白蛋白和纤维蛋白原在Nb-60Ta-2Zr表面的吸附

前言

实验方法

实验结果

讨论

结论

论文二 Nb-60Ta-2Zr的血液相容性研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文三 人脐静脉内皮细胞在Nb-60Ta-2Zr表面的粘附与增殖

前言

实验方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 磁共振兼容的医用金属材料生物相容性

在学期间科研成绩

致谢

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