超脉冲点阵CO2激光在不同治疗参数下对人体光老化前臂皮肤的临床及实验室研究

摘要

前言
　　皮肤是最大的人体器官，长期暴露于紫外线(Ultraviolet，UV)的辐射下，可引起皮肤光损伤，包括光老化和皮肤癌。皮肤光损伤主要表现为:皮肤粗糙、松弛、皱纹、不规则色斑和毛细血管扩张。有多种方法可以实现对光老化皮肤的治疗，常见的有:CarbonDioxide(CO2)激光、强脉冲光(intensepulsedlight，IPL)、Erbium∶YAG(Er∶YAG)激光、红外、射频等。激光焕肤一直被认为是治疗皱纹和光老化皮肤的金标准。然而患者会经历水肿、灼伤、结痂，持续性红斑超过6个月。对于深肤色人群来说，长期的色素沉着、感染以及瘢痕的产生，限制了其在亚洲人皮肤治疗的应用。与剥脱性激光相比，非剥脱性的激光/光虽然不良反应轻微，但是在改善皮肤质地方面疗效不佳。
　　近年来，有学者提出了点阵化的光热作用原理，可以在皮肤上产生一个特定深度和密度的微小热损伤，被称为微小热损伤带(microscopictreatmentzones，MTZs)。MTZs周围皮肤没有损伤，使得热损伤的皮肤可以更迅速的新生。因此，剥脱性点阵激光（尤其是点阵CO2激光）可以产生很好的疗效。但与高加索人不同的是，亚洲人容易诱发炎症后色素沉着(PIH)。我们现在的研究一方面想观察超脉冲点阵CO2激光在不同治疗参数下对人体前臂光老化皮肤颜色的影响。
　　Jeffrey等研究发现Ⅰ型和Ⅲ型前胶原蛋白mRNA的表达与术前相比，在点阵激光术后21天及术后至少6个月分别高达7.5和8.9倍。而MMPs家族mRNA的表达在术后也有明显的升高。我们的研究希望通过高频皮肤超声及铁苏木素染色方法，观察点阵CO2激光在不同参数治疗下，术后不同时点对皮肤胶原纤维和弹力纤维的影响。使用实时定量PCR方法和免疫组织化学染色方法，观察点阵CO2激光对基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)1，3，9，基质金属蛋白酶的组织抑制剂1(tissueinhibitorofmetalloproteinases1，TIMP1)mRNA的表达水平和蛋白水平的影响。
　　材料与方法
　　一、研究对象
　　招募20名中国女性光老化前臂皮肤受试者，双侧前臂光老化皮损对称分布，皮肤类型Ⅱ到Ⅳ型，年龄从38～62岁之间，平均47±8.3岁。排除标准:6个月之内使用过维A酸类药物、瘢痕体质、怀孕、双侧前臂皮损不一致。入组前均告知其风险、利益、术后可能的并发症，并签署知情同意书。于术前、术后不同时点进行病理取材。
　　二、治疗前准备及治疗过程
　　（一）治疗前准备
　　受试者用清水及洗面奶/液清洗双侧前臂皮肤。温度20-25℃，湿度40-50％的室内休息30分钟。指定照像室照相(Nikon，Coolpix5700，Tokyo，Japan)，留取受试者前臂皮肤照片。
　　（二）治疗过程
　　使用超脉冲点阵CO2激光(LumenisOneTM，LumenisLtd，SantaClara,CA，USA)DeepFXTM治疗头扫描一遍进行治疗。将双侧前臂曝光部位皮肤平均分为12个区域，每个区域5cm×2cm。用不同的治疗参数对每一个区域进行治疗。
　　三、疗效评价
　　（一）医生主观评价
　　每个治疗区域在治疗前、末次治疗结束后3个月、1年后随访由医生进行整体评分。评分标准如下:根据光老化的4个临床表现（细小皱纹、粗糙度、不规则色斑、整体评估）进行10分的评价。
　　（二）受试者满意度评价
　　于每个治疗区域治疗结束后3个月、1年时进行，受试者对其治疗区域疗效自评，分为非常满意、满意、一般、不满意四个等级。将非常满意及满意计入满意率。
　　（三）客观评价
　　1、非创伤性评价
　　双侧前臂1～12个区域分别于治疗前、术后5小时，7天，1个月，3个月进行黑素指数(melaninindex，MI)和红斑指数（erythemaindex，EI）测定，每个部位测三次，取平均值。并于治疗前、术后1个月、3个月、1年进行高频皮肤超声测定。
　　2、病理取材皮肤的评价
　　(1)石蜡切片Verhoeff铁苏木素染色分别观察真皮胶原纤维或/及弹力纤维含量。
　　(2)石蜡切片，用免疫组织化学染色方法(SP)法检测MMP1，3，9，TIMP1的表达情况。石蜡组织经脱蜡、抗原修复、一抗、二抗、显色并拍照，用Image-Pro-Plus6.0软件进行面积密度(percentagedensity，PD)值及积分光密度平均值（opticaldensity，OD）值测定。
　　(3)采用荧光实时定量PCR方法检测MMP1，3，9，TIMP1mRNA的表达。按Takara冰冻组织RNA提取试剂说明书提取总RNA;用Takara.PrimeScriptRTregagentKitPerfectRealTime试剂盒反转录合成cDNA;Takara.SYBRPremisExTaq试剂盒SYBR.Green法进行荧光定量PCR扩增，采用双标准曲线法进行相对定量分析。
　　四、统计学分析
　　采用SPSS16FORWINDOWS进行统计学分析。服从正态分布资料采用t检验，服从偏态分布资料采用Mann-Whitney非参数检验;P＜0.05为有统计学差异。
　　结果
　　一、点阵CO2激光对医生主观评分的影响
　　未治疗区域各时间点无差异。与治疗前相比，治疗区域治疗后3个月、1年评分均有不同程度下降，且差异均有统计学意义。术后1年时，当点阵密度固定，能量逐渐增加时，下降程度更为明显，当能量增加至15-20J/cm2时，再次增加能量评分未见继续下降的趋势。当能量固定，密度增加时，下降程度更为明显。
　　二、受试者满意度自评
　　治疗后3个月，当点阵密度固定，能量逐渐增加时，患者满意率为50％～65％，F25-D5和F30-D5区域满意率相对较低，可能系点阵激光术后3个月依然有少量色素沉着。治疗后1年发现，随着能量的逐渐增加，患者满意率也逐渐增高，但当能量增加至15-20J/cm2时，患者满意率基本一致。
　　治疗后3个月，当能量固定，点阵密度逐渐增加时，患者满意率为55％～60％，基本一致。治疗后1年发现，随着点阵密度的逐渐增加，患者满意率也逐渐增高。
　　三、点阵CO2激光对MI/EI值的变化
　　（一）MI/EI均值
　　未治疗区域不同时点均未见明显变化。不同治疗区域MI均值在术后5小时均有不同程度下降;MI均值在术后7天均有回升;术后1个月恢复到基线水平;治疗后3个月随防时依然升高，差异具有统计学意义。
　　不同治疗区域EI均值在术后5小时均显著上升;术后7天依然保持较高水平;术后1个月有所回降;治疗后3个月随防时保持平稳，差异具统计学意义。
　　（二）MI/EI差值
　　不同治疗区域MI差值在术后5小时均变为负值，此时主要是术后即刻皮肤变红所致;术后7天均有很明显的回升，说明点阵激光术后7天皮肤表面已经有黑色结痂脱落;术后1个月恢复到基线水平，此时的皮肤依然泛红，所以MI差值不明显;治疗后3个月随防时依然升高，说明存在PIH。
　　不同治疗区域EI差值在术后5小时均显著上升，说明点阵激光术后即刻存在红斑肿胀现象;术后7天依然保持较高水平，此时的红斑依然较为明显;术后1个月有所回降;治疗后3个月随防时保持平稳，差异具统计学意义，说明术后1-3个月红斑逐渐消退。
　　四、超声皮肤厚度/密度的影响
　　（一）皮肤厚度/密度均值
　　不同治疗区域皮肤厚度均值在术后1个月均显著上升;术后3个月下降;术后1年与治疗前相比无统计学差异。
　　不同治疗区域皮肤密度均值在术后1个月均有所升高;术后3个月升高;术后1年升高最为明显。
　　（二）皮肤厚度/密度差值
　　不同治疗区域皮肤厚度差值在术后1个月均显著上升;术后3个月下降;术后1年与治疗前相比无统计学差异。术后1个月，当点阵密度固定，差值随着能量增加，有逐渐增大的趋势。而术后3个月及1年时，与术前相比，虽然没有统计学差异，但是皮肤厚度随着能量增加，也有逐渐增大的趋势，间接提示点阵激光随着能量的增加，可能会使皮肤增厚。当能量固定时，点阵密度逐渐增加，术后1个月，差值随着密度增加，有逐渐增大的趋势，可能系术后1个月依然存在皮肤轻微肿胀，点阵密度越大，肿胀越明显。术后3个月差值有所下降，1年时皮肤增厚，但增厚程度与点阵密度无明显相关性。
　　不同治疗区域皮肤密度差值在术后1个月均有所升高;术后3个月升高;术后1年升高最为明显。当点阵密度固定时，皮肤密度差值在术后1个月有所升高，但与能量无明显相关性;到了3个月，皮肤密度差值升高，高能量组(F15～F20)处于较高的水平，再次增加能量，皮肤密度未见明显升高，说明术后3个月，皮肤已经开始增厚;术后1年，皮肤密度普遍增高明显，高能量组(F15～F20)处于较高的水平，再次增加能量，皮肤密度未见明显升高，说明术后1年皮肤依然可以变得致密，能量到达F15～F20时，皮肤密度可能已经增加到顶峰，无需继续增加能量进行治疗。当能量固定时，皮肤密度差值在术后1个月至3个月有逐渐升高的趋势，到了术后1年增高最为明显，并且随着点阵密度增加，皮肤密度变得更加致密。
　　五、点阵CO2激光对胶原纤维及弹力纤维的影响
　　术后3个月至1年，治疗区域胶原纤维面密度及积分光密度均显著升高。弹力纤维基本与胶原纤维平行，成波浪形排列。当点阵CO2激光密度固定，能量逐渐增加时，可以见到胶原纤维及弹力纤维的增多呈上升趋势。当点阵CO2激光能量固定，点阵密度逐渐增加时，可以见到胶原纤维及弹力纤维的增多也呈上升趋势。
　　六、点阵CO2激光对MMP1，3，9及TIMP1表达的影响
　　（一）免疫组化显示对MMP1，3，9，TIMP1表达的影响
　　当点阵CO2激光密度固定，能量逐渐增加时，MMP1在治疗后5小时已经开始表达，7天时表达升高，到术后3个月时依然有少量表达，术后1年观察基本无MMP1蛋白的表达，这种表达的变化随着能量的增加有逐渐增多的趋势，但当能量增加到12.5～15J/cm2时，继续增加能量，未见表达继续增多的趋势。MMP3的表达与MMP1相似，但术后3个月表达依然处于较高水平。MMP9蛋白只在术后5小时至7天有少量表达，术后1个月至1年已基本无表达，与能量、密度也存在正相关性。TIMP1在治疗后5小时已经开始表达，7天时表达升高，到术后3个月时依然有较高的表达，术后1年观察MMP1蛋白依然有少量的表达，这种表达的变化随着能量的增加有逐渐增多的趋势，但当能量增加到15J/cm2时，继续增加能量，未见表达继续增多的趋势。
　　当能量固定，密度逐渐增加时，MMP1在术后5小时开始表达，7天时表达升高，到术后3个月时依然有少量表达，术后1年基本无表达，这种表达趋势随着密度增加有逐渐增加的趋势。MMP3蛋白的表达与MMP1的表达相似，但其三个月时表达依然处于较高水平。当能量固定，随着点阵密度增加时，发现TIMP1在治疗后5小时至7天时表达增高，维持高水平至术后3个月，1年时基本降至正常，并与点阵密度增加呈正相关。
　　（二）实时定量RT-PCR显示对MMP1，3，9，TIMP1mRNA表达的影响
　　当点阵CO2激光密度固定，能量逐渐增加时
　　MMP1:不同的治疗组合中MMP1mRNA在治疗后5小时为表达高峰。7天时下降，前五种组合（低剂量组）虽较术前增高，但无统计学差异;后三种组合（高剂量组）依然较术前高表达。MMP1mRNA的表达呈上升趋势，不同治疗组合之间有统计学差异。
　　MMP3:不同的治疗组合中MMP3mRNA在治疗后5小时为表达高峰。7天时下降，但依然较术前表达增高。MMP3mRNA的表达呈上升趋势，不同治疗组合之间有统计学差异。
　　MMP9:不同的治疗组合中MMP9mRNA在治疗后5小时为表达高峰，高剂量组较低剂量组增高明显，7天时下降，1个月、3个月和1年时基本降至正常。随着能量的增加，MMP9mRNA的表达呈上升趋势，高剂量组较低剂量组上升明显，不同治疗组合之间有统计学差异。
　　TIMP1:不同的治疗组合中TIMP1mRNA在治疗后5小时表达增高，7天时达峰值，1个月、3个月和1年时逐渐降至正常。随着能量的增加，TIMP1mRNA的表达呈上升趋势，高剂量组较低剂量组上升明显，不同治疗组合之间有统计学差异。
　　当能量固定，密度逐渐增加时
　　MMP1:不同的治疗组合中MMP1mRNA在治疗后5小时达到高峰，7天时下降，但依然较术前增高，术后1个月、3个月至1年时表达逐渐减少，说明细胞外基质成分降解减少，合成增多。随着点阵密度的增加，MMP1mRNA的表达呈上升趋势，不同治疗组合之间有统计学差异。
　　MMP3:不同的治疗组合中MMP3mRNA在治疗后5小时为表达高峰，7天时下降，但依然较术前略增高，术后1个月、3个月至1年时基本降至正常。随着点阵密度的增加，MMP3mRNA的表达呈上升趋势，不同治疗组合之间有统计学差异。
　　MMP9:不同的治疗组合中MMP9mRNA在治疗后5小时为表达高峰，但只有F5-D20治疗组较术前有统计学差异，7天时下降，1个月、3个月至1年时逐渐降至正常。随着点阵密度的增加，MMP9mRNA的表达在不同治疗组合之间无统计学差异。
　　TIMP1:不同的治疗组合中TIMP1mRNA在治疗后5小时至7天时表达增高，达峰值，术后1个月、3个月和1年时逐渐降至正常。后三个治疗组较第一个治疗组上升明显，不同治疗组合之间有统计学差异。
　　结论
　　1、点阵CO2激光治疗在短期内（3个月内）已经可以达到较好的临床疗效，医生主观评分下降，并且随着点阵能量及密度的增高，满意率逐渐增高，评分有逐渐降低的趋势。长期观察发现，术后1年时，临床疗效更加明显，点阵密度固定时，当能量增加至15-20J/cm2时，已经可以达到很好的临床疗效，无需继续增加能量进行治疗;而能量固定时，随着点阵密度的增加，临床疗效越好。
　　2、点阵CO2激光治疗在短期内（3个月内）可以使得MI/EI升高（多见于高能量密度治疗区域），提示术后3个月，高能量密度组合依然存在PIH。
　　3、点阵CO2激光通过选择性光热作用原理，使光老化皮肤胶原纤维增多、弹力纤维排列正常化，从而在一定程度上恢复皮肤胶原含量及改善皮肤弹性，达到治疗光老化的目的。
　　4、当点阵CO2激光密度固定，能量逐渐增加时，可以见到胶原纤维及弹力纤维的增多呈上升趋势。当点阵CO2激光能量固定，点阵密度逐渐增加时，可以见到胶原纤维及弹力纤维的增多也呈上升趋势。
　　5、点阵CO2激光不同能量密度组合，会影响MMP1，MMP3，MMP9及TIMP1的蛋白表达及mRNA的表达，随着能量的增加或点阵密度的增加，这些指标mRNA和蛋白的表达水平有逐渐上升的趋势，提示不同能量密度的组合，亦会对治疗光老化皮肤的临床疗效有影响。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 脉冲点阵CO2激光不同治疗参数下对人体光老化前臂皮肤的颜色影响

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文二 超脉冲点阵CO2激光不同治疗参数下对人体光老化前臂皮肤的质地影响

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文三 超脉冲点阵CO2激光不同治疗参数下对人体光老化前臂皮肤MMPs家族成员的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 光老化皮肤的激光／光治疗进展

在学期间科研成绩

致谢

个人简历