脂肪干细胞促进大鼠腹主动脉瘤血管壁弹力板重建的研究

摘要

前言:
　　主动脉瘤是一种威胁生命的疾病，患病率随着社会老龄化逐渐增加。可分为胸主动脉瘤和腹主动脉瘤。超出正常血管直径50％以上的局限性腹主动脉扩张，称为腹主动脉瘤(Abdominal aortic aneurysm，AAA)。95％以上的AAA发生于肾动脉以下。AAA的形成因素包含慢性炎症，蛋白水解通路的反应增强，氧化应激及主动脉壁中基质的减少等。腹主动脉壁由内膜、中膜和外膜构成，其中中膜占90％以上。中膜主要是由平滑肌细胞(Smooth muscle cells，SMCs)及其分泌的弹性纤维构成。对于直径较大，破裂危险系数很高的AAA，开放性的手术治疗或血管内的修补是目前被普遍认可的治疗方法。然而，绝大部分的AAA都是较小的，尚未达到手术标准。对于早期较小的AAA选择手术修补并无长期的存活优势，而手术危险系数很高且不适合手术的患者也缺少更好的治疗策略。因此，创新一种非手术的方法治疗AAA势在必行。随着细胞和分子层面上对血管生物学及AAA形成机理认识的深化，一些药物受体，例如他汀类、β受体阻滞剂、血管紧张素转换酶阻滞剂、抗炎症受体、抗生素等都有在实验模型上能够控制AAA的发展过程报道。虽然对一些受体进行了临床实验，然而，临床试验效果欠佳，迄今为止，还没有报道证实有哪种药物能够阻止AAA的发展。随着干细胞治疗的问世，提出了利用干细胞治疗AAA的新设想。
　　脂肪干细胞(Adipose-derived stem cells，ADSCs)是一种存在于脂肪组织中的间充质干细胞。在皮下白色脂肪组织中约占细胞总量的10％-20％，具有一般干细胞的特点，即自我更新和多向分化潜能。这种细胞群易于分离，与骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells，BMSCs)一样，在特定条件下可分化为骨、软骨、心肌细胞等。可以通过脂肪抽吸术或脂肪切除术提取获得，在体外培养中稳定扩增，不易衰老，免疫荧光及流式细胞仪检测显示这种多能干细胞大多数来源于中胚层。ADSCs与BMSCs同属于成体干细胞，但前者比后者更具优势。由于脂肪组织分布广泛，容易获取，对病人创伤少，患者易于接受，细胞群易于分离，增殖速度快，因此具有很好的实验研究优势和临床应用前景。
　　ADSCs能够促进血管新生，从而改善局部缺血组织的血流。这一特点使得ADSCs在临床治疗上具有相当广阔的应用前景。急性心肌梗死、缺血性心肌病、末梢血管疾病、急性肾小管坏死、糖尿病性视网膜病变、缺血性脑病、外伤性脊髓损伤以及移植中发生的局部缺血都将有希望通过ADSCs进行治疗。尽管ADSCs促血管发生的机制尚不清楚，但研究发现ADSCs能够分泌大量血管生长因子。有报道指出ADSCs能够抑制肿瘤坏死因子α，并且促进抗炎细胞因子—白细胞介素10的分泌，表明ADSCs具有抗炎作用，能够抑制炎症。ADSCs已逐渐成为组织工程的种子细胞，并且在某些临床肿瘤的靶向治疗、某些缺血性疾病和代谢性疾病的治疗中得到应用，应用前景广阔。如今ADSCs已成为细胞、基因治疗等研究的热点。虽然已有报道指出利用BMSCs治疗AAA，但迄今为止，国内外尚未见到利用ADSCs治疗AAA的报道。
　　材料与方法:
　　1、SD大鼠ADSCs的分离、培养与鉴定。
　　2、SD大鼠BMSCs分离、培养与鉴定。
　　3、大鼠AAA模型制作。
　　4、共培养模型建立，共分3组:AAA主动脉壁与ADSCs共培养组，AAA主动脉壁与BMSCs共培养组，AAA主动脉壁与培养液共培养组。
　　5、AAA主动脉壁共培养7，14，21d后，用地衣红染色法将动脉壁中弹性蛋白染色。
　　6、Westernblot法检测AAA主动脉壁中弹性蛋白的表达。
　　7、明胶酶谱分析检测AAA主动脉壁中MMPs的活性。
　　8、应用AAA的主动脉进行血管SMCs的原代培养和免疫组织化学鉴定。
　　9、SMCs与ADSCs共培养，并用Real-timePCR检测弹性蛋白与MMPs的基因表达。
　　10、ADSCs注射移植入动物模型体内，注射入PBS作为溶剂对照组，注射入生理盐水作为空白对照组，培养4w，之后手术取出腹主动脉，做明胶酶谱分析，地衣红染色及Western blot检测。
　　实验结果:
　　1、ADSCs原代培养24h即可见细胞贴壁，3d后梭形细胞逐渐增多。约7d左右细胞融合约80％时进行传代。每5d传代一次，传至第3代后细胞形态较为均一，呈长梭形，排列紧密，类似成纤维细胞。用其进行成脂诱导，第14d可见细胞中脂滴出现，折光性强，细胞核溶解消失。进行油红O染色可见大量红色的脂滴。进行成骨诱导，28d可见结节状细胞团，茜素红染色可见红黑色钙结节。
　　2、BMSCs原代培养48h左右可见细胞贴壁，5d后梭形细胞逐渐增多，约10d左右细胞融合80％时进行传代。每7d传代一次，传至第3代后细胞形态较为均一，呈长梭形，排列紧密，类似成纤维细胞。成脂诱导，14d左右细胞内出现空泡状脂滴，油红O染色可见细胞内的脂滴呈红色。成骨诱导，28d左右出现钙结节，茜素红染色可见钙结节被染成黑色，周围呈红色。
　　3、弹性蛋白的地衣红染色:体外培养结果显示，与ADSCs共培养的AAA主动脉壁及与BMSCs共培养的AAA主动脉壁，弹力板紧密排列，呈波浪状，而对照组的AAA主动脉壁，弹力板变直。动物体内实验结果显示，实验组AAA主动脉壁染色后可观察到弹力板呈波浪状排列，而对照组中，AAA主动脉壁染色后观察到弹力板变直。
　　4、Western blot检测弹性蛋白表达:体外实验结果显示，与ADSCs及BMSCs共培养的AAA主动脉壁，随着时间的增加，弹性蛋白逐渐增多。对照组的AAA主动脉壁，弹性蛋白逐渐减少。动物体内试验中，实验组的AAA主动脉壁，相比较对照组的AAA主动脉壁，弹性蛋白明显增加。
　　5、明胶酶谱分析:体外实验结果显示，实验组的AAA主动脉壁，负染条带的宽度随时间的增长，逐渐降低至消失。对照组的AAA主动脉壁，负染条带逐渐明显。体内试验中，实验组的AAA主动脉壁，相比较对照组血管，负染条带宽度明显降低。
　　6、SMCs原代培养:组织块贴壁4h后，翻转培养瓶。4d后，光镜下可看到组织块周围有细胞游离出，此时进行半量换液，7d左右可见细胞融合成片，进行全量换夜。10d左右传代培养，细胞呈中间圆两端尖的形态，排列密集，生长旺盛。免疫组织化学染色可见细胞内大量蛋白染色。
　　7、Real-timePCR:结果可见与ADSCs共培养组的SMCs较对照组，弹性蛋白基因表达增高，MMPs基因表达降低。
　　结论:
　　ADSCs促进AAA模型的血管壁SMCs分泌弹性蛋白，并且抑制MMPs的分泌。

目录

声明

摘要

英文缩略语

前言

材料和方法

一、实验动物

二、主要仪器及试剂

三、实验方法

实验结果

1、ADSCs原代培养及鉴定

2、BMSCs原代培养与鉴定

3、弹性蛋白的地衣红染色

4、Western blot检测弹性蛋白表达

5、明胶酶谱分析

6、平滑肌细胞原代培养

7、Real-time PCR检测平滑肌细胞中elastin，MMP-2及MMP-9基因的变化

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 腹主动脉瘤病理基础及非手术治疗进展

致谢

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