氨基单糖-葡萄糖胺对肺癌细胞增殖抑制作用的研究

摘要

目的：
　　肺癌是因癌症死亡的首要原因，我国每年大约有60万人死于肺癌，其中85％左右为非小细胞肺癌(NSCLC)。肿瘤发生是涉及多种信号转导途径及基因参与的复杂过程，是细胞周期调控紊乱的结果。细胞增殖相关的磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/Akt和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/ERK信号转导通路在多种肿瘤发生过程中被异常激活，研究证明阻断这些信号转导通路，则引起细胞周期阻滞，诱导肿瘤细胞的凋亡，进而抑制肿瘤细胞的生长。
　　葡萄糖胺是一种氨基单糖，在生理条件下可由葡萄糖通过己糖胺生物合成途径生成，临床上作为治疗关节退行性病变的辅助药物广泛应用。近年来的研究证明葡萄糖胺除了具有对白细胞、血管内皮细胞等多种细胞的抗炎作用，也具有抗肿瘤的作用，但具体作用机制尚不清楚。葡萄糖胺进入细胞后代谢生成UDP-N-acetylglucosamine(UDP-GlcNAc)，UDP-GlcNAc能诱导胞浆及核蛋白的O-GlcNAc修饰。
　　由于Cyclin E与FOXO1的表达与肿瘤的发生、预后相关，我们观察了肺癌细胞中Cyclin E，FOXO1的表达情况以及PI3K/Akt通路在肺癌细胞中激活状态。因为Cyclin E与FOXO1的表达受其自身的磷酸化位点的影响，葡萄糖胺能对蛋白质的丝、苏氨酸进行O-GlcNAc修饰，两种修饰又可能存在“阴阳调节”关系;所以我们进一步研究了葡萄糖胺干扰下的细胞周期相关蛋白以及在肿瘤细胞中PI3K/Akt通路的影响。
　　通过对细胞周期相关蛋白CyclinE和FOXO1是一种新的O-GlcNAc修饰蛋白的证明，不仅有助于从分子水平上揭示葡萄糖胺抗肿瘤作用的机制，而且有助于扩展我们对CyclinE和FOXO1自身调控的理解，进一步深入了解O-GlcNAc与磷酸化修饰的生物学意义，这些可能为葡萄糖胺的临床应用提供理论基础与新思路。
　　方法：
　　1、细胞培养，HBE、A549细胞（10％小牛血清的DMEM培养液）、LK2、H460细胞（10％小牛血清的RPMI1640培养液）、饱和湿度、37℃、5％CO2孵箱中传代培养。
　　2、细胞分组，将生长至70％汇合度的A549细胞分组，分为LY294002(浓度25μmol/L)， UO126(浓度10μmol/L)，同时加入LY294002(浓度25μmol/L)和UO126(浓度10μmol/L)，对照组加入等体积的DMSO，作用时间为24小时。
　　3、MTT比色实验检测上述三组，LY294002(浓度25μmol/L)、UO126(浓度10μmol/L)、LY294002(浓度25μmol/L)和UO126(浓度10μmol/L)共同作用，对细胞增殖的影响，通过绘生长曲线，筛选最适作用时间。
　　4、应用流式细胞术（Flow CytoMetry，FCM）检测A549细胞中对照组及各加药处理组细胞周期变化。
　　5、应用RT-PCR法检测A549细胞中对照组及各实验组FOXO1、Cyclin E、p27Kip1、Bim基因的表达差异。
　　6、应用Western-blot法检测肺正常细胞与肺癌细胞系以及组织中的Cyclin E、FOXO1、p-FOXO1的蛋白表达，及A549细胞中对照组及各加药处理组FOXO1、p-FOXO1、Bim、p27Kip1蛋白的表达变化。
　　7、应用免疫荧光法检测FOXO1在非小细胞肺癌A549中的细胞定位情况及不同加药组处理后FOXO1亚细胞定位变化。
　　8、应用双重胸腺嘧啶核苷(TdR)对细胞进行同步化处理，并用流式细胞术检测效果。
　　9、细胞分组，将生长至70％汇合度的A549细胞分组，用不同浓度的葡萄糖胺（0-5mM）作用24小时后收集细胞。
　　10、MTT比色实验检测用不同浓度的葡萄糖胺(0-5 mM)作用24小时后收集细胞，对细胞的生长和增殖情况的影响，并绘制生长曲线，观察葡萄糖胺对细胞增殖的影响。
　　11、应用RT-PCR法检测A549系的各处理组和对照组中FOXO1、CyclinE、p27Kip1mRNA的表达水平的差异。
　　12、应用Western-blot法检测肺正常细胞与及A549细胞中对照组及各加药处理组FOXO1、p-FOXO1、p27Kip1蛋白的表达变化。
　　结果：
　　1、MTT法检测细胞增殖变化
　　LY294002和UO126都能时间依赖性地的抑制A549细胞的增殖，且两种药物联合处理后对细胞的生长抑制作用更加明显，药物作用24小时时，达到最大抑制率。
　　2、流式细胞术检测细胞周期进程
　　FCM结果显示，用LY294002和UO126作用A549细胞24小时后，细胞周期阻滞在G1期的细胞显著增加，两种抑制剂联合应用组比单药组多，而S期的细胞明显减少。
　　3、RT-PCR法检测Cyclin E、FOXO1、Bim、p27Kip1基因的表达
　　RT-PCR结果显示，在A549细胞中，与对照组相比，各加药处理组FOXO1基因表达水平无明显差异，而Bim、p27Kip1mRNA表达水平升高，联合药物组这两种基因的表达增加更明显。CyclinE的mRNA水平的表达在肺癌组织及A549中增加。
　　4、Western-blot法检测Cyclin E、FOXO1、p-FOXO1、Bim、p27Kip1蛋白的表达
　　Western blot结果显示，肺正常细胞与肺癌细胞系中FOXO1的蛋白表达无显著差异，但磷酸化水平与其他几种肺癌细胞系相比较低，Bim、p27Kip1的蛋白水平表达增加，联合用药组加强了对上述p-FOXO1和Bim和p27Kip1表达的影响。两种药物单独及联合作用前后总的FOXO1的表达水平无明显变化。Cyclin E的蛋白水平的表达在肺癌组织及A549中增加。
　　5、免疫荧光法检测FOXO1亚细胞定位
　　免疫荧光结果显示，对照组FOXO1蛋白主要定位于细胞浆，抑制剂LY294002及UO126单独用药组FOXO1部分向细胞核转位，LY294002和UO126联合处理A549细胞时，FOXO1蛋白大部分积聚于胞核。
　　6、MTT法检测细胞增殖变化
　　葡萄糖胺能浓度依赖性地抑制A549细胞的增殖。
　　7、流式细胞术检测细胞周期进程
　　FCM结果显示，葡萄糖胺处理细胞24小时后，细胞周期进程大部分被阻滞在G1期，而S期明显减少。
　　8、RT-PCR法检测Cyclin E、FOXO1、p27Kip1基因的表达
　　RT-PCR结果显示，在A549细胞中，与对照组相比，葡萄糖胺的处理对CyclinE mRNA的表达有抑制作用，而对Bim、p27Kip1基因表达无显著影响。
　　9、Western-blot法检测Cyclin E、FOXO1、p27Kip1蛋白的表达
　　Western blot结果显示，葡萄糖胺的作用使Cyclin E蛋白质的表达显著下降，但是对FOXO1、p27Kip1表达抑制作用不明显。
　　10、Western-blot法检测葡萄糖胺对细胞全蛋白的O-GlcNAc修饰的影响葡萄糖胺显著诱导了A549细胞蛋白质的O-GlcNAc修饰，提示着对相关蛋白的磷酸化的影响。
　　11、Western-blot法检测Cyclin E、FOXO1蛋白的特异位点磷酸化的影响葡萄糖胺的处理抑制了Cyclin EThr-62、FOXO1ser-256的磷酸化水平，提示着对细胞周期的影响。
　　12、葡萄糖胺对PI3K/AKT, MAPK/ERK通路的抑制作用
　　葡萄糖胺抑制了AKT，ERK的磷酸化，即抑制了PI3K/AKT，MAPK/ERK两个通路的激活，这与葡萄糖胺对肺癌细胞抑制作用相关。
　　13、葡萄糖胺对FOXO1细胞内定位的影响
　　葡萄糖胺诱导了FOXO1的胞浆到胞核的核定位，增强了其转录活性。
　　结论：
　　1、PI3K/Akt和MAPK/ERK信号转导通路在非小细胞肺癌细胞系A549的细胞增殖中发挥重要的调控作用。
　　2、PI3K/Akt和MAPK/ERK信号转导通路介导的FOXO1磷酸化，促进A549细胞中FOXO1因子细胞核到胞浆的穿梭。
　　3、抑制PI3K/Akt和MAPK/ERK信号通路，FOXO1转录因子的活性增强，对p27Kip1和Bim在转录水平进行调节，促进细胞周期的阻滞，诱导细胞的凋亡。
　　4、PI3K/Akt和MAPK/ERK信号转导通路在A549细胞的促增殖中存在交互作用。
　　5、Cyclin E的表达与肺癌的发生有一定相关性。
　　6、葡萄糖胺抑制肺癌细胞系的增殖。
　　7、葡萄糖胺诱导的蛋白O-GlcNAc修饰抑制了Cyclin EThr-62、FOXO1 ser-256、AKT、ERK的磷酸化水平，说明两种修饰的相互影响是葡萄糖胺抗细胞增殖可能机制之一。
　　8、葡萄糖胺通过抑制PI3K/AKT，MAPK/ERK两种通路，使FOXO1的转录因子活性增强，进一步影响下游分子及CyclinE的降解，可使细胞阻滞在G1期，促进肿瘤细胞的凋亡。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 Cyclin E和FOXO1在肺癌细胞周期调控中的作用

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

论文二 葡萄糖胺对肺癌细胞周期的影响及其机制

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 MicroRNA与肺癌发生、诊断

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