磁纳米颗粒作为基因载体重编程人脂肪间充质干细胞向胰岛前体细胞分化的研究

摘要

前言：糖尿病是一种因胰岛β细胞数量减少或功能缺陷而致的以糖代谢紊乱为主要临床表现的代谢性疾病。在2000年全球有糖尿病患者1.51亿，而目前糖尿病患者已高达2.85亿，按目前的增长速度，估计到2030年全球将有近5亿人患糖尿病。目前胰岛素注射和降糖药物尚不能根治糖尿病，且糖尿病有微血管及大血管并发症并累及肾、神经系统、视网膜等，这些并发症大大降低了患者的生活质量甚至威胁生命。目前几乎所有的1型糖尿病和部分2型糖尿病患者都需要注射胰岛素来控制血糖，但是这些外源性胰岛素并不能像人体自身分泌的胰岛素那样维持血糖恒定且不能阻止糖尿病并发症的发生。目前干细胞移植已取得一定进展，其将会为糖尿病患者带来新的曙光。人脂肪间充质干细胞(human adiposemesenchymal stem cells，hADSCs)作为干细胞治疗的重要细胞来源，具有取材简单方便、易于体外培养扩增、易于基因修饰等优点，诱导患者自身hADSCs产生的胰岛细胞进行移植，可以避免排斥反应，具有良好的临床应用前景。 胰腺的胚胎发生和胰岛的再生过程均受到多种分子信号的调控，有转录激活因子（如Pdx1、Ngn3、NeuroD1、MafA等），也有转录抑制因子（如REST、SHH等）。通过基因敲除和转基因动物的表型观察发现，这些转录因子的表达是按照一定层级进行的。去除胰岛细胞分化过程中的抑制性因素并表达促进因素很有可能是hADSCs遵循胰岛β细胞早期发育规律，分化为胰岛β细胞的基本条件。 目前，基因导入载体主要分为病毒型和非病毒型。病毒型基因载体虽转染效率较高，但具有诱导宿主免疫反应、潜在成瘤性、装载容量有限和代价高等缺点。因此，非病毒基因载体的应用日益受到重视。随着纳米科学的发展，纳米材料在生物检测、疾病诊断及治疗等方面均展示出了广阔的应用前景。在众多的纳米材料中，超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxid, SPIO)以其非侵袭性、低毒性和对细胞膜强大的穿透性等特点，被认为是很有前景的非病毒基因导入载体，并已经成为生物医学中实际应用的最成功的纳米材料之一。 因此，在本实验中我们人工合成了REST-siRNA、SHH-siRNA，用聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)包被的SPIO(PEI-SPIO)作为基因载体将其共转染hADSCs，观察其重编程hADSCs分化为胰岛前体细胞的能力。 方法： 一、hADSCs的原代培养; 二、hADSCs的传代培养及冻存复苏; （一）细胞的传代 （二）细胞的冻存及复苏 三、hADSCs的流式细胞鉴定; 四、PEI-SPIO标记hADSCs; 五、普鲁士蓝染色鉴定PEI-SPIO对hADSCs的标记; 六、台盼蓝染色检测PEI-SPIO对hADSCs活性的影响; 七、MTT法检测PEI-SPIO对hADSCs增殖能力的影响; 八、PEI-SPIO标记对hADSCs潜在多向分化能力的影响; （一）成骨诱导分化及鉴定 （二）成软骨诱导分化及鉴定 （三）成脂肪诱导分化及鉴定 九、MTT法检测PEI-SPIO和脂质体作为基因载体对细胞活性的影响; 十、免疫荧光法检测PEI-SPIO作为基因载体的转染效率; 十一、PEI-SPIO作为基因载体的瞬时干扰效率检测; （一）实时定量PCR法检测PEI-SPIO作为基因载体的瞬时干扰效率 （二）Western-blot法检测PEI-SPIO作为基因载体的瞬时干扰效率 十二、实时定量PCR法检测hADSCs共转染REST-siRNA和SHH-siRNA后胰岛细胞相关基因的表达; 十三、统计学分析。 实验结果： 一、hADSCs的分离和培养原代培养hADSCs24小时后，倒置相差显微镜下进行观察，已有少量细胞贴壁。48小时后首次换液可以观察到一些圆形发亮的脂肪细胞及其他杂细胞混浮于培养液中，贴壁细胞的形态不一，较24h贴壁的细胞比较更为伸展。第4-5d贴壁的hADSCs已经形成克隆集落，呈放射状或旋涡状生长，当细胞生长至80％融合时，进行传代。传代细胞很快贴壁，2-4h就可以见贴壁细胞，大约10h左右细胞基本贴壁完成。传代至P3时细胞形态较均匀一致，细胞呈长梭形均匀贴壁分布。 二、hADSCs细胞表面抗原标志物流式细胞学鉴定流式细胞仪(Flow cytometer, FCM)检测结果显示，hADSCs不表达造血细胞和内皮细胞的典型标志分子CD34，其细胞表面主要表达CD105和CD90。表明所分离的hADSCs不包含造血干细胞及成熟的造血细胞，并不属于内皮细胞，是一群高表达间质细胞表面分子的细胞。 三、PEI-SPIO标记hADSCs的鉴定不同浓度PEI-SPIO标记细胞可见胞质内不同数量蓝色致密颗粒分布。铁终浓度6mg/L组hADSCs的标记效率为96％。铁终浓度8、10和12mg/L组hADSCs的标记效率均为99％，未标记组未观察到蓝染颗粒，呈阴性。 四、不同浓度PEI-SPIO标记对hADSCs活性影响未标记组活细胞比率为97.12％，铁浓度为6和8mg/L活细胞比率分别为96.28％和96.21％，与未标记组无差异;铁浓度为10和12mg/L活细胞比率分别为79.03％和70.23％，显著低于未标记组。 五、不同浓度PEI-SPIO标记对hADSCs增殖能力检测铁浓度为6和8mg/L标记细胞和未标记细胞有相似增殖活性，而铁浓度为10mg/L和12mg/L标记细胞的增殖活性受到不同程度抑制。 六、PEI-SPIO标记对hADSCs潜在多向分化能力的影响 （一）对成骨分化能力影响:PEI-SPIO终浓度为8mg/L时，成骨诱导分化21d后，可见细胞呈多层生长的结节状，碱性磷酸酶染色呈阳性。PEI-SPIO终浓度为10mg/L时标记的细胞在诱导培养3d后，细胞外形胀大，发生不规则变化，胞膜破裂，细胞内容物外溢，大部分细胞死亡，成骨诱导失败。 （二）对成软骨分化能力影响:PEI-SPIO终浓度为8mg/L时，细胞在软骨诱导液诱导21d后可见细胞体积明显增大，数量增多，细胞变得宽大扁平，胞质丰富，细胞由单层变成多层生长，局部可见细胞集聚形成团块状结晶，艾茜蓝染色呈阳性。PEI-SPIO终浓度为10mg/L时标记的细胞在诱导培养5d后细胞外形胀大，发生不规则变化，胞膜破裂，细胞内容物外溢，大部分细胞死亡，成软骨诱导失败。 （三）对成脂分化能力影响:PEI-SPIO终浓度为8mg/L时，细胞在成脂肪诱导分化7d后，均发现少量细胞中有小脂滴出现，约14d后可以看见大部分细胞胞体变大，油红染色证实为脂肪滴。PEI-SPIO终浓度为10mg/L时标记的细胞在诱导培养5d后细胞外形胀大，发生不规则变化，胞膜破裂，细胞内容物外溢，大部分细胞死亡，成脂诱导失败。 七、PEI-SPIO和脂质体作为基因载体转染hADSCs后对其活性的影响转染48h后，未转染组hADSCs的A490为0.80±0.03，PEI-SPIO组转染hADSCs的A490为0.75±0.06，脂质体组转染A490为0.64±0.04。 八、PEI-SPIO作为基因载体的转染效率观察用PEI-SPIO携带绿色荧光蛋白(GFP)转染hADSCs，在倒置荧光显微镜下观察GFP的表达，可以反映出磁纳米颗粒的转染效率。转染24h后倒置荧光显微镜下即可见绿色荧光，表明磁纳米颗粒已经进入到细胞并开始表达GFP，转染效率为71％。 九、REST-siRNA、SHH-siRNA转染hADSCs后干扰效率检测用PEI-SPIO作为基因载体将体外人工合成的REST-siRNA和SHH-siRNA转染hADSCs。24h后提取RNA，48h后提取蛋白，用Westem-blot和Real time PCR相对定量法检测PEI-SPIO载体对hADSCs中目的基因的干扰效率，PEI-SPIO载体能使其相应的目的基因REST和SHH的表达呈不同程度的降低。PEI-SPIO作为基因载体介导REST-siRNA转染hADSCs后REST的蛋白表达量为0.501±0.006，显著低于对照组的0.924±0.003; REST的RNA表达量为0.46±0.04，显著低于对照组的1.00±0.08。PEI-SPIO作为基因载体介导SHH-siRNA转染hADSC后SHH的蛋白表达量为0.523±0.004，显著低于对照组的1.000±0.007;SHH的RNA表达量为0.53±0.05，显著低于对照组的1.00±0.04。 十、hADSCs共转染REST-siRNA和SHH-siRNA后胰岛细胞相关基因表达的检测通过Real time PCR相对定量法检测胰岛分化相关基因的表达，insulin、pdx1、ngn3、pax4的表达都呈不同程度的升高。 结论：适当浓度的PEI-SPIO可标记hADSCs且不影响其生物特性，利用PEI-SPIO作为基因载体重编程hADSCs可使其分化为胰岛前体细胞。

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摘要

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研究内容

研究目的

技术路线框架

材料试剂与仪器

实验方法

实验结果

讨论

结论

创新性

参考文献

综述 人脂肪间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化的研究进展

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