原代大鼠脑微血管内皮细胞异质性和生物学特性初步研究

摘要

目的：
　　我们描述并且比较两种不同方法获得微血管内皮细胞(brain micro-vascularendothelial cells，BMECs)的方法;其目的是为了展现出不同方法获得微血管内皮细胞的生物学特性，以及探讨这两种方法在细胞生成上是否存在不同。
　　材料和方法：
　　一、脑微血管内皮细胞的原代提取和培养
　　一种方法用机械和酶分解的方法处理脑组织，主要涉及密度离心和免疫磁珠纯化等步骤，另一种方法包括机械分离，两次酶消化，20％BSA和percoll离心，加入完全培养基:高糖DMEM、20％PDS、4ug/mL嘌呤霉素（仅应用2天）、100ug/mL肝素、4ng/mL bFGF、10ug/mL内皮细胞生长支持物、2mM L一谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素以及0.25ug/mL两性霉素B。12小时后首次换液以去除未贴壁的细胞及血管段;放入37℃，5％CO2孵箱，每隔两天换液一次。
　　二、蛋白免疫印迹分析
　　用刮刀将BMECs混成，溶于匀浆，溶于PBS以1000R离心5min。弃上清后加入裂解液，细胞溶液放置于冰上10min，震荡1min后，15000g离心5min。收集上清，采用BCA试剂盒测试浓度。上样后，跑胶，转膜，脱脂奶粉室温封闭2小时。 TBST洗膜3次(10min/次)，一抗孵育过夜，第二天辣根过氧化物酶孵育后上机发光。
　　三、免疫荧光
　　当BMECs长满后，去除培养基，溶于1xPBS冲洗3次。预冷100％乙醇被用作兔抗大鼠血管第八因子抗体;固定30分钟，4％多聚甲醛用于固定兔抗大鼠Claudin-5固定剂，室温下固定30min。PBS冲洗3次后，0.1％Triton X-100细胞膜打孔5min，PBS清洗后加入5％BSA室温封闭30min。一抗用1％BSA封闭后在4℃下孵育过夜。荧光二抗（FITC异硫氰酸荧光素山羊抗兔IgG，TRITC四乙基若丹明异硫氰酸盐山羊抗兔IgG）用1％BSA(包含DAPI苯基吲哚/蓝色荧光5μg/ml)稀释并且样品在37℃避光孵育半小时。
　　四、体外血脑屏障的建立及通透性
　　通过Millicell-ERS（电阻系统）得到的3天的初级电镀来评估TEER。当BMECs聚集时，1μM荧光素钠的DMEM加入到Transwell系统的上面。计根据下层小室荧光钠的吸光度，计算出单层BMECs的通透性。
　　五、细胞内钙离子测定
　　将细胞放入有含有Fluo-3/AM(10μmol/ml)的DMEM中避光30分钟，孵育后用ACSF冲洗掉过多的Fluo-3/AM。BK刺激后细胞内Ca2+变化采用在共聚焦显微镜下在激发波长为488nm，发射波长为505nm的数值下进行测量，F0为细胞静息状态下的荧光变化，△F为变化后的数值与静息状态下的数值的比值，整个细胞的钙离子变化为％△F/F0。
　　结果：
　　最终的的细胞通过内皮的特殊抗原(von willebrand fact和claudine-5)，跨内皮电阻(trans-endothelial electrical resistance，TEER)，荧光蛋白渗透性和细胞内Ca2+变化的测量来测定鉴定。最后我们从原代细胞中获得了两种生物学特性的细胞并且经过鉴定均为微血管内皮细胞，这两种内皮细胞在形态学、生态学特性、跨内皮电阻、应用缓激肽后的反应和内皮细胞的屏障作用均有所差异。
　　结论：
　　缓激肽10-5M触发原代脑微血管内皮细胞钙离子波，细胞外钙离子是钙离子峰的前提和必要条件:此钙离子波属于钙触发钙离子释放机制。我们也发现两种方法获得的BEMCs在细胞形态、TEER、和应用BK后的反应上存在不同，可能是由于细胞的异质性。

目录

声明

摘要

英文缩略语

前言

材料和方法

一、材料及试剂

二、大脑皮质微血管内皮细胞培养

三、大脑皮质微血管内皮细胞的鉴定

三、平均BMEC区域定量分析

四、BMECs屏障功能

五、细胞内Ca2+变化的测量

六、统计学分析

结果

一、两种方法获得的BMECs的生长特点：它们是不同的

二、鉴定两种不同形态的BMECs

三、TEER和通透性测量值的分析显示两种方法获得的BMECs有正常的屏障功能

四、两种方法获得的BMECs在应用BK后的不同反应

讨论

一、原代培养内皮细胞形态及生长特点

二、原代培养BMECs的屏障作用

三、原代培养BECs应用BK后Ca2+变化不同

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 原代大鼠脑微血管内皮细胞异质性和生物学特性初步研究

致谢

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