二甲基砷酸对大鼠膀胱上皮细胞NF-κB信号通路及其下游凋亡和炎性相关因子表达的影响研究

摘要

二甲基砷(DMAv)是无机砷在体内甲基化代谢的主要产物，随尿液排出体外。动物实验表明大鼠长期暴露DMAv可引起膀胱癌，特别是膀胱上皮细胞肿瘤发生率升高，DMAv被认为是大鼠膀胱的致癌剂和促癌剂，然而DMAv的作用机制还不清楚，可能与氧化应激、炎症反应、增殖凋亡失衡有关。
　　氧化应激是因机体内部的氧化与抗氧化平衡失调所致，过量的活性氧和自由基能激活多条信号通路产生异常反应，造成组织细胞损伤。NF-κB是一种调控多种基因表达的核转录因子，参与调控细胞分化发育以及凋亡，还可以调控绝大多数炎性因子。研究表明NF-κB信号通路在许多肿瘤中高度表达，且与肿瘤分化程度显著相关。IKK（由IKKα、IKKβ等组成）是NF-κB信号通路磷酸化IκB的激酶，NF-κB（主要亚单位有P65、P50等）在与IκB解离后，修饰入核，发挥转录调节作用。抗凋亡基因Bcl2是细胞凋亡的关键基因，和促凋亡基因Bax共同决定细胞凋亡的走向，CASPASE3是细胞凋亡的主要效应因子，能直接提示凋亡的发生。Erbb2是NF-κB信号通路上游的癌基因，其过度表达可通过启动多种转移相关机制而增加细胞迁移能力。
　　大量研究表明，炎症在肿瘤发生发展中起着重要作用，许多炎症因子的存在能够刺激肿瘤细胞增殖、侵袭、粘附等。TGFβ是一种重要的炎性因子，可抑制免疫功能、增加血管的生成、诱导细胞外基质的产生而促进肿瘤的侵袭和转移。白介素1β，主要发挥免疫调节作用，可促进炎症细胞的聚集、活化和炎症介质的释放，调节炎症反应。
　　目的:
　　本研究通过观察DMAv暴露大鼠膀胱上皮细胞NF-κB信号通路的活化状态，以及增殖和炎性因子的变化，了解DMAv对大鼠膀胱上皮的作用，为砷致膀胱癌机制的研究提供基础数据。
　　方法:
　　一、动物分组与染毒
　　60只健康Wistar雌性大鼠(40～50 g)经一周适应环境后，随机分成3组，每组20只，经饮水染毒。三组分别为对照组:饮蒸馏水;100 ppm DMAv染毒组;200 ppm DMAv染毒组。各组大鼠自由饮水，染毒10周。
　　二、测量指标与方法
　　（一）ABTS法检测血清中A-TOC和TBA法检测血清中的MDA。
　　（二）Realtime-PCR法检测大鼠膀胱上皮细胞IKKα、IKKβ、IκBa、p65、p50、Bcl2、Bax、Caspase3、Erbb2 mRNA表达水平。
　　（三）免疫组化法检测大鼠膀胱上皮细胞IKKa、IKKβ、p-P65、p-P50、P52、BCL2、BAX、CASPASE3、TGFβ蛋白水平。
　　（四）ELISA法检测大鼠尿中IL1β水平。
　　三、统计分析
　　采用SPSS18.0软件进行数据的统计分析。数据采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t或Dunnett T3检验，相关分析采用Pearson或Spearman相关分析。
　　结果:
　　一、血清中氧化应激相关指标
　　200 ppm DMAv染毒组大鼠血清中A-TOC显著高于对照组(p＜0.05)，呈剂量-效应关系。MDA水平在各组差异无统计学意义。
　　二、膀胱上皮细胞NF-κB信号通路相关因子mRNA和蛋白表达水平
　　IKKa和p50 mRNA在染毒组表达较对照组有显著增高(p＜0.05)，IKKβ, p65,IκBα在染毒组与对照组比较，差异无统计学意义。
　　免疫组化的结果看到DMAv染毒组大鼠IKKα和IKKβ表达均显著高于对照组(p＜0.05)，P65，P50，P52在膀胱上皮细胞核阳性率也显著高于对照组(p＜0.05)。
　　三、大鼠膀胱上皮细胞凋亡相关因子mRNA和蛋白水平
　　200 ppm DMAv染毒组大鼠膀胱上皮细胞Bcl2 mRNA显著高于对照组(p＜0.05)，呈剂量-效应关系。Bax、Caspase3、Erbb2 mRNA在各组间差异无统计学意义。Bcl2/Bax在染毒组有增高趋势，但差异无统计学意义。
　　200 ppm DMAv染毒组大鼠膀胱上皮细胞CASPASE3蛋白表达显著低于对照组(p＜0.05)，呈剂量-效应关系。BAX和BCL2蛋白表达水平在各组间差异无统计学意义。
　　四、大鼠膀胱上皮细胞TGFβ和尿中IL1β蛋白水平
　　染毒组大鼠膀胱上皮细胞中TGFβ蛋白表达水平均高于对照组(p＜0.05)，尿IL1β分泌水平在200 ppm DMAv染毒组高于对照组和100 ppm DMAv染毒组(p＜0.05)，呈剂量-效应关系。
　　结论:
　　1、经饮水暴露DMAv大鼠血清A-TOC上升。
　　2、暴露DMAv大鼠膀胱上皮细胞NF-κB信号通路主要因子IKKα、IKKβ、p65、P50、P52表达升高，说明DMAv能够激活大鼠膀胱上皮细胞NF-κB信号通路。
　　3、暴露DMAv大鼠膀胱上皮细胞抗凋亡因子Bcl2 mRNA水平增高，促凋亡因子CASPASE3降低，呈抗凋亡趋势。
　　4、暴露DMAv大鼠膀胱上皮细胞TGFβ表达和尿中IL1β分泌增加，说明DMAv能增加大鼠膀胱上皮细胞炎症反应。

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结论

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参考文献

综述 NF-κB在肿瘤发生发展中的作用

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