宫内发育迟缓新生大鼠胰腺发育相关转录因子的表达

摘要

目的：
　　宫内发育迟缓（Intrauterine growth retardation，IUGR）是指由于胎儿、母亲或胎盘等各种不利因素导致胎儿在宫内生长模式偏离或低于其生长预期，即偏离了其遗传潜能。通常是指新生儿出生体重小于同胎龄儿平均出生体重的第10个百分位或2SD的婴儿。受双亲遗传因素、孕妇营养状况、地理环境、药物、微量元素、子宫胎盘血流量、宫内感染等多种因素影响。宫内发育迟缓不仅会造成围产期死亡率增加，目前研究表明宫内发育迟缓者远期并发症（如神经系统发育障碍及成年后患冠心病、高血压病、糖尿病、肾病等）的危险度比正常出生体重儿明显增加。
　　Hales和Barker提出的“节俭表型假说”，Lucas于1998年提出了“营养程序化(nutritional Programming)”的概念，用以阐述早期营养不良对成年期的持续影响，但详细机制尚不清楚。研究发现宫内发育迟缓个体的胰腺β细胞发育受损，我们可以通过研究胰腺发育的相关转录因子表达情况，揭示宫内发育迟缓个体胰腺发育受损的原因。
　　利用低蛋白饮食建立IUGR模型，研究胰腺发育的相关因子Pdx1、Nkx2.2、Nkx6.1和MafA在IUGR的表达情况，可以探究IUGR个体易发生Ⅱ型糖尿病的可能机制。
　　方法：
　　一、动物实验
　　（一）实验动物
　　清洁级Wistar大鼠18只，其中雄性3只，雌性15只，体重250～290g。
　　（二）实验方法
　　1、动物模型制备
　　适应性饲养7天后，雌雄鼠按5∶1比例合笼，次晨8:00-9:00时涂片，以镜下见精子作为受孕第1天，孕鼠按受孕顺序随机分为低蛋白组和对照组，用孕鼠低蛋白饮食法建立IUGR模型。低蛋白组自妊娠第1天起给予低蛋白饲料（蛋白含量6％～8％）喂养，对照组给予标准饲料（蛋白含量18％）喂养直至自然分娩，饲料其余成分相同或相近，两组饮水无限制。所有孕鼠均自然分娩，于娩出后12h内称量新生大鼠体重，精确到0.01g，低蛋白组新生大鼠体重低于对照组新生大鼠平均体重2个标准差的纳入IUGR组。
　　2、标本取材
　　称量低蛋白组及对照组新生大鼠体质量、鼻尾长，将符合IUGR标准的新生大鼠和对照组新生大鼠处死，显微解剖镜下完整分离胰腺，用分析天平称量胰腺重量，迅速将胰腺置于4％多聚甲醛溶液中固定，准备做石蜡切片，准备进行HE染色和免疫组化。随机挑选IUGR组和对照组新生大鼠各12只，处死前禁食6小时，心脏采血测定空腹血糖。腹腔注射葡萄糖2g/Kg体重，测定糖负荷后30分钟、60分钟和120分钟血糖值。
　　3、胰腺组织的镜下观察
　　4、免疫组织化学法检测Nkx2.2和Nkx6.1的表达。
　　5、实时荧光定量PCR检测Pdx1、MafA和Nkx6.1 mRNA的表达。
　　二、统计学方法
　　采用SPSS16.0统计软件处理，数据以（x）±s表示，符合正态分布的数据组间比较采用t检验。不符合正态分布的数据采用秩和检验;以P＜0.05为具有统计学意义。
　　结果：
　　一、低蛋白饮食组IUGR造模情况
　　低蛋白组新生大鼠体重，身长（鼻尾长）均显著低于对照组(P＜0.05)低蛋白组。
　　二、IUGR组和对照组新生大鼠葡萄糖耐量实验结果比较
　　IUGR组新生大鼠空腹血糖低于对照组(t=2.16，P＜0.05)，予以糖负荷后30分钟、60分钟差别无统计学意义，120分钟时，血糖高于正常组。（t=5.438，P＜0.05）
　　三、IUGR组和对照组新生大鼠胰腺发育情况
　　新生大鼠IUGR组HE染色后可看出胰腺形态较正常组松散，胰岛数量减少，胰岛面积减少。胰腺重量较对照组胰腺重量减少，P＜0.05有统计学意义。
　　四、IUGR组和对照组新生大鼠Nkx2.2表达情况的比较
　　Nkx2.2在胰岛细胞的胞浆表达，部分腺泡上皮细胞的胞核表达，阳性反应部位呈棕黄色。IUGR组阳性反应部位的平均光密度，与对照组阳性反应部位平均光密度相比略有减低，但P＞0.05，无统计学意义。
　　Nkx2.2在IUGR组阳性反应面积，与对照组阳性反应面积相比显著降低，P＜0.05，有统计学意义。
　　五、IUGR组和对照组新生大鼠Nkx6.1表达情况的比较
　　Nkx6.1在胰岛细胞的胞浆表达，阳性反应部位呈棕黄色，IUGR组阳性反应部位的平均光密度对照组阳性反应部位平均光密度相比显著降低，P＜0.01，有统计学意义。
　　NKx6.1在IUGR组阳性反应面积与对照组阳性反应面积相比显著降低，P＜0.05，有统计学意义。
　　六、IUGR组Pdx1、MafA、Nkx6.1mRNA相对表达量
　　RT-PCR结果显示，IUGR组Pdx1 mRNA相对表达量低于对照组，P＜0.05，IUGR组MafA mRNA相对表达量低于对照组，P＜0.05，IUGR组Nkx6.1 mRNA相对表达量低于对照组(P＜0.01)，有统计学意义。
　　结论：
　　宫内发育迟缓的新生大鼠胰腺中发育相关转录因子Pdx1、MafA和Nkx6.1的表达均有减低，可能是影响新生儿胰腺发育及功能完善的原因之一。

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综述 宫内发育迟缓与胰腺发育

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