双氢青蒿素抑制博来霉素致肺纤维化大鼠炎症、纤维化及氧化应激过程的研究

摘要

肺纤维化(PF)是近年发病率有上升趋势的一种弥漫性间质性肺疾病，发病机理复杂，进展迅速，病死率高。临床观察和实验证实，PF在发生发展中，除了涉及细胞（凋亡、转型）、细胞因子（TGF-β，TNF-α，IFN-γ等）及核转录因子NF-κB等机制外，还有研究表明在这个过程中存在明显的氧化应激状态。甚至有学者提出活性氧可能是肺纤维化患者组织损伤的真正原因。因此，深入探讨IPF发生发展过程中的这些机制并加以调控，对治疗本病将具有重要的理论价值和现实意义。
　　青蒿素是用菊科植物黄花蒿叶提取的，青蒿琥酯、双氢青蒿素等是其衍生物，发现这些衍生物具有抗炎、抗组织纤维化及免疫调节等作用。因此本研究建立博来霉素致大鼠肺纤维化动物模型，并分别与地塞米松及N-乙酸半胱氨酸的疗效作对比，探讨双氢青蒿素对博来霉素致肺纤维化大鼠的干预作用及对炎症、胶原纤维合成及氧化应激过程的影响，为有效防治肺纤维化提供实验数据。
　　第一部分:双氢青蒿素对博来霉素致肺纤维化大鼠的干预作用
　　方法:健康清洁级雄性Wistar大鼠54只，随机分为6组，每组9只。分组如下：
　　①正常对照组(NS组): NS组于造模实验当天气管内一次性注射与BLM组等体积生理盐水，第2日起每日腹腔注射等体积生理盐水;②博来霉素模型组(BLM组):BLM组于造模实验当天气管内一次性注射含博来霉素的生理盐水5mg/kg(浓度4mg/ml)，第2日起每日腹腔注射等体积生理盐水;③双氢青蒿素低剂量治疗组(DHA-1组):DHA-1组于造模实验当天气管内一次性注射含博来霉素的生理盐水5mg/kg(浓度4mg/ml)，第2日起每日腹腔注射DHA(25mg/kg·d);④双氢青蒿素中剂量治疗组(DHA-2组):DHA-2组于造模实验当天气管内一次性注射含博来霉素的生理盐水5mg/kg(浓度4mg/ml)，第2日起每日腹腔注射DHA(50mg/kg·d);⑤双氢青蒿素高剂量治疗组(DHA-3组):DHA-3组于造模实验当天气管内一次性注射含博来霉素的生理盐水5mg/kg(浓度4mg/ml)，第2日起每日腹腔注射DHA(100mg/kg·d);⑥地塞米松治疗组(DXM组):DXM组于造模实验当天气管内一次性注射含博来霉素的生理盐水5mg/kg(浓度4mg/ml)，第2日起每日腹腔注射DXM(3mg/kg·d)。
　　于造模后第7、14及28天，每组分别取3只大鼠进行麻醉后处死，取左肺下叶固定于10％甲醛溶液行HE染色及MASSON染色观察判断肺泡炎及肺纤维化评分;剩余肺组织入深低温冰箱保存进行肺组织羟脯氨酸含量的检测。
　　结果:①肺泡炎评分:BLM组、DHA-1，2，3组及DXM组的肺泡炎评分在第7及14d均比NS组高，差别有统计学意义(P＜0.05); DHA-1，2，3组及DXM组的肺泡炎评分在第7及14d均比BLM组的评分低，差异有统计学意义(P＜0.05); DHA-1组与DXM组的差异有统计学意义(P＜0.05); DHA-2，3组与DXM组的差异无统计学意义(P＞0.05）。②肺纤维化评分:BLM组、DHA-1，2，3组及DXM组的肺纤维化评分在第14及28d均比NS组高，差别有统计学意义(P＜0.05）;DHA-1，2，3组及DXM组的肺纤维化评分在第14及28 d均比BLM组的评分低，差异有统计学意义(P＜0.05); DHA-2，3组与DXM组相比较，在第7及14d的差异有显著性意义(P＜0.05); DHA-1组与DXM组的差异无统计学意义(P＞0.05）。DHA-2和DHA-3组相比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。③肺组织中HYP含量的检测:DHA-1，2，3组和DXM组在第14及28天的含量均明显低于BLM组，差异有统计学意义(P＜0.05); DHA-2，3组与DXM组相比较，在第14及28d的差异有显著性意义(P＜0.05); DHA-1组与DXM组的差异无统计学意义(P＞0.05）;DHA-2和DHA-3组相比较，差异无统计学意义(P＞0.05）;在第7天六组间的差异无显著性意义(P＞0.05）。
　　第二部分:双氢青蒿素对博来霉素致肺纤维化大鼠TGF-β1，TNF-α，α-SMA和NF-κB表达的影响
　　方法:动物分组及造模同实验一。
　　于造模后第7、14及28天，每组分别取3只大鼠进行麻醉后处死，取左肺下叶固定于10％甲醛溶液行HE染色及MASSON染色观察判断肺泡炎及肺纤维化评分;取左肺剩余组织固定于10％甲醛溶液，进行TGF-1，TNF-α，α-SMA和NF-κB的免疫组织化学染色观察;右肺肺组织入深低温冰箱保存，分别采用Western blotting和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法进行TGF-β1，TNF-α，α-SMA和NF-κB的蛋白和mRNA表达的检测。
　　结果:①免疫组织化学染色结果:BLM组、DHA-1，2，3组及DXM组的肺组织TGF-β1，TNF-α，α-SMA和NF-κB的表达在第7、14及28 d均比NS组高，差异有统计学意义(P＜0.05); DHA-1，2，3组及DXM组的TGF-β1，TNF-α，α-SMA和NF-κB的表达在在第7、14及28 d均比BLM组的低，差异有统计学意义(P＜0.05); DHA-2，3组与DXM相比较，差异有显著性意义(P＜0.05); DHA-1组与DXM组的差异无统计学意义(P＞0.05); DHA-2和DHA-3组相比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。②Western blotting检测结果:DHA-1，2，3组及DXM组的TGF-β1，TNF-α，α-SMA和NF-κB的表达在第7、14及28 d均比BLM组的低，差异有统计学意义(P＜0.05); BLM组、DHA-1，2，3组、BLM组及DXM组的肺组织TGF-β1，TNF-α，α-SMA和NF-κ B的表达在第7、14及28 d均比NS组高，差异有统计学意义(P＜0.05）;DHA-2，3组与DXM相比较，在第7、14及28 d的差异均有显著性意义(P＜0.05); DHA-1组与DXM组的差异无统计学意义(P＞0.05); DHA-2和DHA-3组相比较，差异无统计学意义(P＞0.05）。③RT-PCR检测结果:DHA-1，2，3组及DXM组的TGF-β1，TNF-α，α-SMA和NF-κB mRNA的含量在在第7、14及28 d均比BLM组的低，差异有统计学意义(P＜0.05); BLM组、DHA-1，2，3组及DXM组的肺组织TGF-β1，TNF-α，α-SMA和NF-κB mRNA的含量在第7、14及28 d均比NS组高，差异有统计学意义(P＜0.05);DHA-2，3组与DXM相比较，差异有显著性意义（P＜0.05）。DHA-1组与DXM组的差异无统计学意义(P＞0.05）。DHA-2和DHA-3组相比较，差异无统计学意义(P＞0.05）。
　　第三部分:双氢青蒿素对实验性大鼠肺纤维化氧化应激过程的影响
　　方法:健康清洁级雄性Wistar大鼠60只，随机分为4组，每组15只。分组如下：
　　①正常对照组(NS组): NS组于造模实验当天气管内一次性注射与BLM组等体积生理盐水，第2日起每日腹腔注射等体积生理盐水;②博来霉素模型组(BLM组):BLM组于造模实验当天气管内一次性注射含博来霉素的生理盐水5mg/kg(浓度4mg/ml)，第2日起每日腹腔注射等体积生理盐水;③双氢青蒿素治疗组(DHA组):DHA组于造模实验当天气管内一次性注射含博来霉素的生理盐水5mg/kg(浓度4mg/ml)，第2日起每日腹腔注射DHA(50mg/kg·d);④N-乙酸半胱氨酸（NAC组）:NAC组于造模实验当天气管内一次性注射含博来霉素的生理盐水5mg/kg(浓度4mg/ml)，第2日起每日腹腔注射NAC(400mg/kg·d)。
　　于造模后第7、14及28天，每组分别取5只大鼠进行麻醉后处死。取左肺下叶固定于10％甲醛溶液行HE染色及MASSON染色观察判断肺泡炎及肺纤维化评分;其余肺组织入深低温冰箱保存，进行丙二醛(MDA)，谷胱甘肽（GSH）及超氧化物歧化酶(SOD)含量的检测。
　　结果:①肺泡炎与肺纤维化评分:同实验一。②肺组织中GSH与SOD检测结果:二者在DHA组及DXM组的表达在第14及28 d均比BLM组的高，差异有统计学意义（P＜0.05）;而BLM组、DHA组及DXM组的表达在第7、14及28 d均比NS组低，差异有统计学意义(P＜0.05）。③肺组织中MDA检测结果:在DHA组及DXM组的表达在第14及28 d均比BLM组的低，差异有统计学意义(P＜0.05）;而BLM组、DHA组及DXM组的表达在第7、14及28 d均比NS组高，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　全文结论：1、双氢青蒿素抑制博来霉素致大鼠肺纤维化模型的纤维化病变，其疗效在剂量≥50mg/kg·d时（腹腔注射用药）优于地塞米松。
　　2、双氢青蒿素在转录与翻译水平上抑制博来霉素致大鼠肺纤维化模型肺组织中TGF-β1，TNF-α，α-SMA和NF-κB的表达，说明其疗效与抑制病变过程的炎症与肌成纤维细胞活动有关。
　　3、双氢青蒿素干预实验性大鼠肺纤维化氧化应激过程，MDA含量降低;GSH与SOD含量升高，纠正氧化-抗氧化失衡。
　　4、双氢青蒿素可作为潜在的治疗肺纤维化的药物，可作为进一步筛选的对象。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 双氢青蒿素对博来霉素致肺纤维化大鼠的干预作用

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

论文二 双氢青蒿素对博来霉素致肺纤维化大鼠TGF-β1，TNF-α，α-SMA和NF-κB表达的影响

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

论文三 双氢青蒿素对实验性大鼠肺纤维化氧化应激过程的影响

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

本研究创新的自我评价

参考文献

综述 肺纤维化氧化应激机制研究进展

在学期间科研成绩

致谢

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