小鼠皮肤损伤愈合过程中大麻素2型受体对caspase-3，9表达影响的研究

摘要

目的：
　　皮肤创伤愈合是一个连续而复杂的生物学过程，它受到许多细胞及细胞因子的调控。经典的皮肤损伤愈合过程包括炎症期、纤维增生期和组织重建期，这三个时期在时间上相互重叠但又具有不同特点。研究证明，细胞凋亡参与了皮肤损伤愈合的过程。现在一般认为caspase-9是内源性细胞凋亡途径中的启动子，它在接受凋亡信号的刺激后自我活化，进一步激活下游的caspase-3。Caspase-3是细胞凋亡过程中最重要的终末剪切酶，它一旦被激活，细胞凋亡就进入了不可逆阶段。本实验在小鼠皮肤损伤后注射大麻素2型受体(CB2R)的激动剂GP1A和拮抗剂AM630，应用Western blot技术检测它们对caspase-3，9活化片段的蛋白表达影响;应用Real-Time PCR检测它们对caspase-3，9mRNA相对表达量的影响。
　　实验材料与方法：
　　健康成年（8周龄）清洁级昆明系小鼠155只，雄性，体重35-42g。按照处理因素不同随机分为3组，溶剂对照组、CB2R激动剂GP1a组和CB2R拮抗剂AM630组。每组按照伤后存活时间不同，随机分为12h、1d、3d、5d、7d、9d、11d、13d、17d和21d组，每组5只，另有5只健康小鼠作为空白对照。
　　小鼠适应性饲养一周（5只/笼），环境温度为18-20℃，维持12小时昼夜节律，自由进食、饮水。小鼠腹腔注射2％戊巴比妥钠(15mg/kg)麻醉，剃毛备皮、碘伏消毒后，用2.5cm宽运动胶带固定小鼠双前肢和颈背部皮肤，3M型通气透明胶带固定背部预处理皮肤。用直径为6mm的眼科环钻分别于小鼠背部左、右两侧各打1个孔，建立皮肤切除动物模型，两孔位置在小鼠背部最高点脊柱两侧中线1cm处。小鼠于造模后即时分别腹腔注射GP1a、AM630或溶剂，药物浓度3mg/kg（2.225ml/kg），之后每日按顺序给药直至取材前一日。各组小鼠分别于伤后12h、1d、3d、5d、7d、9d、11d、13d、17d和21d腹腔注射过量2％戊巴比妥钠处死，生理盐水灌流后冰上取创口及其周围1.0cm×1.0cm皮肤组织，随机取一侧样本用于石蜡切片的HE染色，另一部分用于Western blot和Real-Time PCR检测。应用HE染色检测皮肤损伤愈合过程中的形态学变化;Westernblot检测caspase-3，9活化片段的蛋白表达变化情况;Real-Time PCR检测caspase-3，9mRNA相对表达量的变化情况。数据采用均数±标准差（(X)±S）表示，用SPSS13.0 for Windows统计软件对各组数据进行单因素方差分析，组间比较采用LSD或Tamhane's法，p＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果：
　　Western blot结果显示皮肤损伤愈合过程中，溶剂对照组伤后各时间段内caspase-3，9活化片段的蛋白表达有一定的时间规律:caspase-3活化片段的蛋白表达在伤后1d有所增加，伤后3-7d达到峰值，随后逐渐恢复至正常水平;caspase-9活化片段的蛋白表达在伤后1-3d达到峰值，之后逐渐下降至正常水平。在皮肤损伤愈合早期，GP1a组caspase-3，9活化片段的蛋白表达低于溶剂对照组，AM630组caspase-3，9活化片段的蛋白表达高于溶剂对照组，差异有统计学意义。Real-Time PCR结果显示，皮肤损伤愈合过程中，溶剂对照组各时间段caspase-3，9mRNA相对表达量有一定的时间规律;caspase-3的mRNA相对表达量在伤后1d达到峰值，随后逐渐下降接近正常水平;caspase-9的mRNA相对表达量在伤后12h达到峰值后逐渐下降。在皮肤损伤愈合早期，GP1a组caspase-3，9的mRNA相对表达量低于溶剂对照组，AM630组caspase-3，9的mRNA相对表达量高于溶剂对照组，差异有统计学意义。
　　结论：
　　1、小鼠皮肤损伤愈合过程中溶剂对照组caspase-3，9活化片段的蛋白表达变化及caspase-3，9的mRNA相对表达量的变化具有时间规律性，有望用于皮肤损伤时间的推断。
　　2、GP1a能够在皮肤损伤愈合早期下调caspase-3，9活化片段的蛋白表达量及mRNA的相对表达量;AM630可上调caspase-3，9活化片段的蛋白表达量及mRNA的相对表达量，提示激活CB2R可抑制caspase-3，9的表达，抑制CB2R可促进caspase-3，9的表达。

目录

声明

摘要

英文缩略语

前言

实验材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 皮肤损伤愈合中大麻素受体及细胞凋亡的相关性研究

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