HA/SF/CS及SF/CS支架材料与人成骨细胞hFOB1.19体外共培养的对比实验研究

摘要

目的:
　　临床上由于感染、肿瘤、创伤等因素造成的骨组织缺损比较常见，目前解决骨组织缺损主要的治疗手段是骨移植术，但各种骨移植术都有一定的局限性。自体骨移植修复容易造成供骨区的创伤和功能受限，而异种、异体骨移植因存在交叉病毒感染、免疫排异反应的缺点受到了诸多限制。目前骨组织工程已被认为是修复部分骨组织缺损最有希望的治疗方法，骨组织工程包含以下三个方面，即种子细胞（成骨细胞）;组织工程化骨组织的构建;生物支架材料。其中，骨支架材料的开发及应用在修复骨缺损的治疗中充当着至关重要的角色。用于骨组织工程的支架材料应具备较高的孔隙率及三维多孔结构、出色的生物相容性及表面活性、灵活的可塑性及与骨再生速率相适宜的生物降解性。由于单一的支架材料不能完全符合骨支架的各项性能要求，将不同性能的材料通过特殊的手段有机地结合到一起，从而获得具有更优异性能的生物支架材料，并在实验研究及临床应用中取得了良好的效果。
　　丝素蛋白(Silk Fibroin，SF)是天然蚕丝脱胶制得的高分子纤维蛋白质，具有很好的抗拉伸强度、热稳定性、透气透湿性等，且对组织无毒性反应。丝素蛋白加工灵活，可制各出如粉剂、溶液及纤维等多样的形式。目前有研究表明其在体外与多种细胞进行复合培养时，丝素蛋白膜均展现出较高的细胞增殖率和细胞黏附率，由此说明丝素蛋白可作为生物支架材料，以进一步用于组织工程领域（软骨、血管、皮肤等诸多方面）的研究，但单独应用丝素蛋白时降解速度过快且机械性能欠缺，因此通常将其与机械性能较好的材料相复合，共同用于组织工程骨缺损修复方面的开发和研究。
　　壳聚糖(Chitosan，CS)是由甲壳素部分脱乙酰基后形成的一种能在体内降解吸收的天然生物多糖，由(1，4)交联β-D-葡糖胺的重复单位组成，降解产物对人体及组织无免疫反应，并起到消炎及促进组织愈合的功能。壳聚糖在骨组织修复中的应用，已经受到国内外广泛的关注，如今在人工骨替代物、手术缝合线等方面都有广泛的研究和应用，但单独将壳聚糖应用于骨组织缺损修复时，其机械性能尚不能满足实际需要。
　　羟基磷灰石(Hydroxyapatite，HA)其化学组成及结构与人体骨中无机矿物质相近，不仅机械强度及生物相容性良好，而且具有出色的骨诱导性和骨传导性，由于上述特点，羟基磷灰石用作骨支架材料可耐受压力较大或承重的部位，是目前研究及应用最普遍的骨组织工程无机生物陶瓷支架材料之一。然而，单一羟基磷灰石因其脆性较大和降解速率过低，某种程度上使其在骨组织工程中的应用受到了诸多限制。
　　不同成分的支架材料各有其优缺点，单一材料的性能往往不能满足骨组织工程支架材料的所有需求。采用不同的制备方法将不同材料有机的组合在一起形成复合型支架材料，在材料的降解速率及力学性能方面可以使其性能互补，从而获得更佳的综合性能。
　　本实验通过仿生矿化法及冷冻干燥技术分别制备出HA/SF/CS及SF/CS骨组织工程支架材料，并对两种支架的理化性能进行表征;将人成骨细胞hFOB1.19分别接种于HA/SF/CS及SF/CS支架中，体外研究并比较两种支架材料对人成骨细胞hFOB1.19早期黏附、增殖及分化的作用影响，评价两种支架材料作为骨组织工程支架的细胞相容性，为生物支架材料的设计及临床应用提供理论和实验依据。
　　方法:
　　1.通过仿生矿化法及冷冻干燥技术分别制备HA/SF/CS和SF/CS两种支架材料，采用扫描电镜(SEM)、力学测试、液体置换等手段，对上述两种支架的微观形貌、机械强度、孔隙率及溶胀率等进行检测。
　　2.复苏并传代培养人成骨细胞hFOB1.19，逐日对细胞的形态、生长及增殖状况进行观察并照相记录。
　　3.实验共分为3组，即HA/SF/CS组、SF/CS组及空白对照组。将人成骨细胞hFOB1.19体外接种于上述三组中进行共培养，扫描电镜下观察细胞生长及增殖情况。应用细胞计数法、CCK-8法、碱性磷酸酶试剂盒测试成骨细胞早期黏附率、细胞增殖率及成骨分化的活性，分别评价与比较HA/SF/CS和SF/CS支架材料对人成骨细胞hFOB1.19黏附、增殖与成骨分化的影响。
　　结果:
　　1.HA/SF/CS和SF/CS支架材料电镜下观察均具有良好的多孔结构，孔隙之间相交织成网状结构。SF/CS支架的孔隙率为86.1±6.3％，平均孔径大小为265±71μm，溶胀率为13.6±0.9％，吸水率为314±13％，压缩模量为16.35±2.89MPa，压缩强度为0.67±0.13MPa; HA/SF/CS支架内部与表面沉积着许多微小的羟基磷灰石晶体颗粒，孔隙率为75.5±5.9％，平均孔径大小为210±59μm，溶胀率为7.2±0.6％，吸水率为248±9％，压缩模量为23.19±2.53MPa，压缩强度为1.03±0.11MPa。其中在孔隙率、溶胀率、吸水率、压缩模量及压缩强度这五项指标中，两种材料的差异具有统计学意义。
　　2.人成骨细胞hFOB1.19传代后约2小时开始有梭形细胞贴壁，24小时后存活细胞全部贴壁。细胞贴壁后的形态不规则，呈梭形或鳞片状，可见有伪足伸出;培养三天后，细胞数量明显增多，开始表现为成骨细胞样形态。
　　3.三组的细胞黏附率随时间的延长而增加，HA/SF/CS组和SF/CS组的细胞黏附率均显著高于空白对照组，HA/SF/CS组显著高于SF/CS组，差异均有统计学意义;三组的细胞增殖随时间的延长而增加，培养至第5天时，HA/SF/CS组和SF/CS组的细胞增殖均显著高于空白对照组，培养至第7天时，SF/CS组显著高于HA/SF/CS组，差异有统计学意义;三组细胞分泌的碱性磷酸酶活性随时间的延长而增加，培养至第7天时，HA/SF/CS组和SF/CS组的细胞碱性磷酸酶活性均显著高于空白对照组，培养至第10天时，HA/SF/CS组显著高于SF/CS组，差异有统计学意义。
　　结论:
　　1.通过冷冻干燥法及仿生矿化技术制备的HA/SF/CS和SF/CS支架材料的理化性能均符合生物支架材料的要求。相比之下，我们认为机械性能较为出色的HA/SF/CS支架材料更适用于承重颌骨部分缺损的修复。
　　2.HA/SF/CS和SF/CS两种支架在体外与人成骨细胞hFOB1.19共培养中均显示出良好的细胞相容性，且HA/SF/CS比SF/CS具有更显著的促进细胞成骨分化的能力。由此可认为HA/SF/CS支架因其更优异的成骨活性和机械性能，在颌骨部分缺损的修复重建中拥有更为良好的应用前景。

目录

声明

摘要

英文缩略语

前言

实验材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性自我评价

参考文献

综述 骨组织工程复合支架材料的研究进展

在学期间科研成绩

致谢

个人简介