细胞凋亡模型中HIPPI表达量变化与潜在功能的研究及mtDNA多态性在PD群体中的调查

摘要

目的：
　　细胞凋亡(apoptosis)是多细胞生物应对生理及病理性刺激，产生的由基因及其产物调控的应答有序的自主的死亡过程。机体以此消除衰老、损伤与突变的细胞，维持生理平衡。有关细胞凋亡的研究发现，它与人体众多生理过程密切相关，如胚胎发育、器官的发育与退化、免疫、造血、细胞群体稳定等，并在获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)、神经退行性疾病（阿尔兹海默病、帕金森氏病、舞蹈病）及肿瘤的发生和治疗中起着重要作用。因而，细胞凋亡的研究日益受到人们的关注，成为当今生物学的研究热点之一。细胞凋亡的主动性和程序性涉及了一系列基因的激活、表达以及调控等过程，现已分析鉴定到许多与细胞凋亡相关的基因，如dad-1、ras、myc、p53、bcl-2。近年来，随着分子生物学突飞猛进的发展，关于细胞凋亡分子机制的研究有了很大的突破，其中，bcl-2家族、caspase家族、p53蛋白、survivin蛋白都是重要的凋亡调节因子，在细胞凋亡中相互联系，相互作用，调控细胞凋亡。[1]
　　亨廷顿蛋白相互作用蛋白1相互作用因子(HIP-1(Huntingtin-interactingprotein-1)proteininteractor，HIPPI）是细胞凋亡过程中涉及到的多功能蛋白之一。已有文献报道，HIPPI在体内外与一些蛋白相互作用，使caspase-8活化，进而激活了caspase介导的细胞凋亡途径的起始信号，导致细胞凋亡的发生。[2～5]近期数据显示，在除草剂百草枯(paraquat，PQ)诱导SH-SY5Y细胞建立起来的帕金森氏病(Parkinson's disease，PD)研究模型中，发现了众多与PD发病相关的基因，且这些基因大多与细胞凋亡有关，在经PQ作用后，半胱天冬酶家族中caspase-3、-6、-7在mRNA水平有所升高，而caspase-1、-5、-9、-10的水平则有所下降[6]。上述表达发生变化的基因，大多在细胞凋亡途径的发生与发展过程中起着关键作用，提示PD的发病与细胞凋亡存在着某种程度的相关性。综上所述，HIPPI的表达参与了细胞凋亡的发生和发展，并且可能在神经退行性疾病的发病机制中扮演着重要角色。
　　除了环境因素的影响外，遗传易感性是另一个公认的与PD发生相关的重要因素。已有文献指出，线粒体功能异常可能与神经退行性疾病有关，比如PD和阿尔兹海默病(Alzheimer's disease，AD)[7～9]，且在PD患者中已经发现了复合体Ⅰ的损伤[10～13]。在动物模型中，抑制复合体Ⅰ将导致多巴胺能神经元的选择性退化，这是PD的一个重要特征[14]。线粒体DNA编码复合体Ⅰ的七种蛋白亚单位，线粒体基因组的基因多态性可能会增加PD的患病风险[15]。一些国家在PD患者和对照人群中进行了几个线粒体单核苷酸多态性(single nucleotide polymotphism，SNP)位点的分型，数据显示，多个线粒体SNP位点可能对PD的发病有着显著作用[16～19]。
　　鉴于PD研究模型中发现了众多凋亡相关基因的表达变化，然而HIPPI是否通过细胞凋亡途径参与PD的发病，以及作用机制如何，至今尚无相关报道;而且，虽然有研究表明HIPPI参与细胞凋亡等过程，但现阶段的研究基本基于HeLa细胞和Neuro2A细胞模型[20～23]。本研究采用PQ诱导的SH-SY5Y细胞凋亡模型，辅以氯化镉(cadmium chloride，CdCl2)诱导的HEK293细胞凋亡模型，研究HIPPI在rnRNA水平及蛋白水平表达量变化及相关的分子机制，探究HIPPI在细胞凋亡发生发展过程中所充当的角色，进而探究其参与PD发病的机制。
　　此外，在亚洲人群，尤其是中国人群中，与PD相关的线粒体多态性研究匮乏[24]。因此，本课题也运用PCR-RFLP技术对中国北方322位PD患者和332位健康对照人群进行了5个线粒体SNP位点的分型，比较两个人群之间的基因频率和单倍型频率差异，并在性别分层后进行二者的比较，以探讨中国北方人群中这几个线粒体SNP对PD发病的影响。这将为PD的预防和治疗提供一定的参考依据。
　　方法：
　　1、细胞增殖与毒性检测试剂盒(MTS)检测HEK293细胞经CdCl2诱导后细胞的存活率变化，多功能酶标仪在490nm波长下读取吸光度值，并在倒置相差显微镜下观察毒素诱导细胞后发生的形态学改变;
　　2、蛋白免疫印迹方法(western blot，WB)检测CdCl2诱导的HEK293细胞内caspase-3前体(pro-Casp-3)及多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP）的表达量变化，分析CdCl2可否通过caspase-3依赖的方式诱发HEK293细胞凋亡;
　　3、实时荧光定量PCR分析CdCl2诱导前后HEK293细胞内及PQ诱导前后SH-SY5Y细胞内HIPPI的mRNA水平表达变化;
　　4、将含HIPPI基因完整编码区的重组质粒转染至HEK293细胞和SH-SY5Y细胞中使其过表达;
　　5、WB分析在细胞中过表达HIPPI后，CdCl2诱导前后HEK293细胞内及PQ诱导前后SH-SY5Y细胞内HIPPI蛋白量的变化，以及z-VAD-fmk预处理对凋亡细胞中HIPPI蛋白表达变化的影响;
　　6、提取外源性HIPPI蛋白，采用人重组caspase-3、-6、-7分别进行酶切消化，验证HIPPI蛋白可否被caspase酶切;
　　7、收集中国北方PD患者与健康人群血液样本，酚-氯仿法提取基因组DNA，采用PCR-RFLP法对5个线粒体SNP位点进行分型，探讨其与PD的相关性。
　　结果：
　　1、采用30μM CdCl2诱导HEK293细胞24h，此时细胞存活率为50％，基此构建细胞毒性模型;
　　2、CdCl2诱导的HEK293细胞内可见pro-Casp-3含量明显降低，同时部分PARP裂解，泛caspase抑制剂z-VAD-fmk可有效减少CdCl2诱导的细胞凋亡，并使细胞内pro-Casp-3含量明显恢复，说明CdCl2诱导HEK293细胞后以caspase-3依赖的方式导致细胞凋亡;
　　3、PQ诱导的SH-SY5Y细胞内HIPPI mRNA表达水平增高，CdCl2诱导的HEK293细胞内HIPPI mRNA表达水平降低，但二者均无统计学差异;
　　4、转染HIPPI基因完整编码区重组质粒的HEK293细胞，经CdCl2诱导后HIPPI蛋白表达量较对照组明显下降，而z-VAD-fmk预处理可有效阻滞这一下降过程;
　　5、在体外研究中，转染HIPPI基因完整编码区重组质粒的HEK293细胞，可检测到分子量约为55kDa的HIPPI完整蛋白，经人重组caspase-3酶切消化后蛋白量显著降低，而caspase-6、-7酶切后未观察到明显蛋白表达量变化;
　　6、中国北方人群中线粒体ND3基因上的A10398G位点与PD相关，而这一相关性在女性人群中尤为突出;
　　7、单倍型4336T-5460G-9055G-10398A-13708G的频率在病例和对照人群之间存在显著差异，进行性别分层后，单倍型4336T-5460G-9055G-10398G-13708G和4336T-5460G-9055G-10398A-13708G均在女性人群的病例组与对照组之间存在显著性差异。
　　结论：
　　1、CdCl2可抑制HEK293细胞增殖，并导致HEK293细胞凋亡;
　　2、伴随CdCl2诱导的HEK293细胞凋亡，其细胞中过表达的HIPPI蛋白表达水平下降;泛caspase抑制剂可以恢复CdCl2诱导的HEK293细胞凋亡模型中HIPPI蛋白的表达水平;
　　3、在CdCl2诱导的HEK293细胞凋亡模型中，过表达的HIPPI蛋白可能是easpase-3的底物;
　　4、在中国北方人群中，线粒体多态性与PD发病之间存在一定的相关性，而这一相关性可能表现出女性遗传偏倚。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 细胞凋亡模型中HIPPI表达量变化及潜在功能的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文二 mtDNA多态性在PD群体中的调查

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 HIPPI研究进展

在学期间科研成绩

致谢

个人简介