纯钛表面亲水性能的维持与恢复及其对成骨细胞生物活性影响的研究

摘要

近半个世纪以来，人工种植牙得到了临床上的认可，获得了广泛的应用，但是还存在一些需要解决的问题:①临床上植入体内的种植体达到可以负载的时间比较长，②良好的骨结合是种植体成功的关键，但现在的种植体与骨的结合率仍然较低，这将对种植体的长期稳定有消极的影响。有大量的研究表明，种植体的失败大部分发生在愈合早期，那么在愈合早期防止不利因素的发生显得尤为重要。
　　近几年来，钛材料的亲水性表面对成骨细胞的生物学作用已逐渐得到了研究者的认可，亲水性表面能够提高成骨细胞的粘附率，明显促进成骨细胞的增殖与分化，对于骨结合有积极的作用。但有研究表明钛片表面的亲水性能有一定的时效性，会随着放置时间的延长越来越弱，这将不利于骨结合。在保存过程中种植体的亲水性能或多或少发生了变化，如何维持亲水性能这值得我们深入研究。
　　由于在临床工作中，往往临床医生拿到钛种植体时都已经经过或长或短的保存时间，其表面的亲水性能很可能已经出现了降低，与之相应的生物学性能也就有所下降。因此，如何使种植体的表面维持亲水状态是一个重要的研究课题。本研究从处理方法的角度出发，研究不同处理方法对亲水特性长期维持的影响，以尽可能保持钛片表面的超亲水性能，使应用到临床的种植体能够拥有更佳的骨结合效果。
　　目的：
　　1、探究钛片经过NaOH溶液处理是否可以维持或者恢复其表面的亲水性能。
　　2、探讨钛片表面亲水特性与生物学性能之间的关系。
　　方法：
　　1、钛片的制备及分组
　　将TA4纯钛切割成两种规格:一种为直径15mm，厚度1.5mm;另一种为直径10mm，厚度1.5mm。分别一半进行喷砂酸蚀(SLA)处理，另一半进行等离子体氧化处理，在进行等离子体氧化处理之前，钛片试样均已进行过喷砂酸蚀处理，试样放进真空室前，试样依次在去离子水和无水乙醇中各超声清洗5min，烘干冷却后直接放入真空室，并开始抽真空。氧化前钛片表面进行了Ar等离子体的清洗，所有样片表面形态较为均匀，表面清洁度良好。分组:
　　组1:SLA钛片常温常压空气中保存10天进行实验，简称SLA;
　　组2:SLA钛片常温常压空气中保存10天后0.1M NaOH液体浸泡10s进行实验，简称SLA+短碱;
　　组3:等离子体氧化钛片常温常压空气中保存10天后0.1M NaOH液体浸泡10s进行实验，简称氧化+短碱;
　　组4:等离子体氧化钛片常温常压保存于0.1MNaOH液体中10天进行实验，简称氧化+长碱（此组样片于真空环境下制备后直接置于NaOH液体中，整个过程未接触空气）。
　　以上试验均在清洁环境中完成。
　　2、钛片表面理化性能的检测
　　通过扫描电镜观察钛片表面的形貌，利用水接触角分析仪分析钛片表面亲水性，从而用以评估实验中四组钛片表面的理化性能的差异。
　　3、蛋白吸附试验
　　本实验应用两种蛋白为模型蛋白:牛血清白蛋白(BSA)和人纤连蛋白(FN)，利用BCA蛋白浓度测试试剂盒法在波长562nm波长下测定OD值，然后根据标准曲线计算蛋白质的吸附率（百分比）。
　　4、细胞培养实验
　　本实验选用MC3T3-E1成骨细胞系，在不同培养时间点，通过细胞骨架染色法、扫描电镜法、MTT法、ALP试剂盒法对成骨细胞的粘附铺展、增殖及分化情况进行分析，用来分析比较本实验中四组钛片表面的细胞生物学活性。
　　统计分析
　　采用Spss17.0统计软件对本实验各组样品的蛋白质吸附率、细胞增殖和分化方面各项参数进行统计学分析。测定结果用平均数和标准差进行描述，组间进行单因素方差分析，假设检验为双侧检验，检验水准α=0.05，当P＜0.05时，认为差异具有统计学意义，当P＜0.01时，认为差异具有显著的统计学意义。
　　结果：
　　一、材料理化性能分析
　　1、扫描电镜观察结果:SLA以及氧化的钛片均具有典型的喷砂酸蚀后的表面形态，表现为表面呈现较均匀的多孔状结构，孔径为1-5μm，说明等离子体氧化并不能改变钛片表面的形貌。氧化钛片在0.1mol/L的碱液(pH=13)浸泡前后的表面形貌也没有明显变化，说明此碱液并不能并改变钛片表面的形貌。
　　2、经过静态水接触角检测可得结果，四组材料表面的静态水接触角大小从高到低为SLA＞氧化+短碱＞SLA+短碱＞氧化+长碱，而接触角越小亲水性能越高。
　　二、材料的蛋白吸附实验
　　四组不同处理方法钛片的蛋白吸附率结果显示:在四个时间点均是氧化+长碱组钛片表面的蛋白质吸附率最高，而SLA钛片表面的蛋白吸附能力最弱。
　　三、材料生物学性能分析
　　1、成骨细胞在材料表面的粘附铺展情况
　　在四组材料表面，成骨细胞接种培养6h后SLA短碱、氧化短碱和氧化长碱材料表面均出现了成骨细胞的丝足结构，并且组4伪足要较其他组长，而SLA材料表面成骨细胞刚刚见到伸展形态，尚无此结构。细胞培养24h后可见SLA短碱、氧化短碱和氧化长碱材料表面丝足结构已经生长为片足结构，而SLA材料表面也已经出现了刚刚伸张为丝足的结构。48h后细胞在四组材料上的形态无明显的差别，都表现出正常的成骨细胞形态。
　　2、成骨细胞在材料表面的增殖情况
　　通过MTT法检测，成骨细胞培养1d、3d、5d、7d后，四组材料表面的细胞数量均随培养时间的延长而增多，在四个检测时间点，四组材料表面成骨细胞的增殖情况由高到低排列均为:氧化长碱＞氧化短碱＞SLA短碱＞SLA。
　　3、成骨细胞在材料表面的分化情况
　　细胞内碱性磷酸酶活性测定结果为，分别培养3d、5d、10d和15d后四组材料表面的成骨细胞内ALP活性均为随培养时间的延长而增强。在每个时间点ALP活性的高低顺序均为:氧化长碱＞氧化短碱＞SLA短碱＞SLA。
　　4、成骨细胞在材料表面的细胞骨架形态
　　培养1h后，SLA及SLA短碱材料表面成骨细胞大部分还是圆形，未见铺展，氧化短碱材料表面细胞初见铺展，细胞铺展面积未见明显增加，而氧化长碱材料表面成骨细胞铺展面积较其它3组要大，并且几乎所有细胞均有铺展。培养2h后，相比1h时四组均未见明显变化。培养4h后，四组材料铺展面积均增加，有明显的伸展，并且四组铺展面积由高到底为:氧化长碱＞氧化短碱＞SLA短碱＞SLA。培养24h后，所有细胞均明显增大，伸展长度均明显增加，并且各组材料之间细胞的形态与大小均没有明显的区别。
　　结论：
　　1、常温常压空气中保存的纯钛，其表面亲水性能一旦降低，应用0.1mol/LNaOH溶液短暂处理可以恢复一定程度的亲水性能，但未能恢复其超亲水性状态。
　　2、将自始至终未接触过空气的纯钛一直保存于NaOH溶液中能够较好的维持其表面的超亲水性性能。
　　3、同种工艺制备的钛片其表面的亲水性能越好，那么相应的生物学性能也就越好。

目录

声明

摘要

英文缩略语

前言

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 增强钛种植体表面亲水特性研究进展

在学期间科研成绩

致谢

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