羊膜上皮细胞在去表皮真皮上构建组织工程皮肤并用于皮肤再生的实验研究

摘要

背景：
　　近年来，各种组织工程皮肤如Apligraf VR、Dermagraft VR等已应用于临床进行创面的修复。现组织工程皮肤的种子细胞大多是同种异体的角质形成细胞，但从诸多方面考虑，角质形成细胞并不是一种理想的种子细胞。为使组织工程皮肤更好的应用于临床，用羊膜上皮细胞(hAECs)作为种子细胞将是一个更好、更有新意的选择。hAECs较其他细胞更有优势在于它具有向三个胚层分化的可塑性，且它表达生长因子(EGF、KGF、HGF)及抗炎和抗菌的细胞因子，这些有利于创面的愈合。因羊膜是产后废弃物，取材容易，且无伦理学争议。重要的是，hAECs与人类的胚胎干细胞不一样，它不表达端粒酶，故在移植时不会形成肿瘤。因hAECs免疫源性低，因此在移植后发生免疫排斥的风险很低。故hAECs在组织工程皮肤再生中是一个有前景的种子细胞。
　　除种子细胞外，选择合适的真皮替代物是构建组织工程皮肤的关键。虽然目前大多数的真皮替代物能够模拟真皮的结构和功能，但几乎都缺乏有效的基底膜结构和功能，表皮的角质形成细胞在这种缺乏基底膜的真皮替代物上会逐渐失去增殖能力。为解决这一问题，越来越多的研究者都在寻求一种具备基底膜结构的真皮支架。大量研究表明通过在真皮替代物上添加天然或人工合成的基底膜成分，体外构建的模型中表皮的角质形成细胞的增殖会明显增强，且形成的人工表皮层的功能也有明显的改善。去表皮的真皮组织(DED)是把皮肤组织从基底膜(BM)的透明层处去除表皮而获得的，故在DED的表面保留了大多数的基底膜成分，如层粘蛋白、Ⅳ型胶原和Ⅶ型胶原等。故具有完整基底膜结构的DED有利于hAECs的分化、复层、角化，使得构建的组织工程皮肤与正常人皮肤更加接近。
　　目的：
　　本实验研究人羊膜上皮细胞及人去表皮真皮组织的特征，利用人羊膜上皮细胞在去表皮真皮上构建出组织工程皮肤并对其性状进行研究，后用构建的组织工程皮肤修复裸鼠创面缺损，为羊膜上皮细胞及人去表皮真皮在再生医学中的应用奠定实验基础。
　　方法：
　　一、羊膜上皮细胞的分离培养及真皮替代物的制备
　　1、HAECs的分离培养:本实验采用低浓度胰酶多步消化分离法来提取hAECs。将羊膜组织用PBS反复冲洗后剪成制成约1cm×1cm大小，加入含有0.05％胰酶-0.02％EDTA溶液，37℃消化10min，弃消化液（主要去除杂细胞和细胞碎片）。重复上述方法消化上皮细胞，37℃消化30-40min，200目不锈钢网过滤。收集单细胞悬液，加含10％胎牛血清(FBS)的培养基终止消化。过滤后组织碎片用同样方法重复消化1次。离心收集的细胞用添加10ng/mLEGF的L-DMEM完全培养基培养，置于37℃、5％ CO2孵育箱内培养。24h首次换液，后每3天换液一次，约10天后细胞可按常规方法传代培养。
　　2、DED的制备:健康成年人皮肤标本常规消毒，加入适量PBS，置于4℃冰箱中待制备。制备前用PBS清洗标本数次，常规消毒。用眼科剪小心去除皮下脂肪组织层，制成1cm×1cm大小皮片。浸于56℃PBS中30min。用眼科镊去除表皮。将DED置于Epp管中，迅速置入液氮中约5min，取出后室温放置30min，然后再置入液氮中，连续10个循环。后置于-20℃冰箱中保存备用。
　　3、HAECs及DED生物学特征检测:HAECs细胞爬片后进行相关的免疫组化染色，包括广谱细胞角蛋白(CKpan)免疫组化染色、CK18免疫组化染色、Oct-3/4及SSEA-4免疫荧光检测。流式细胞仪检测hAECs的细胞周期。与DED相关的组织染色包括HE染色，PAS染色，波形蛋白(Vim)免疫组化染色，VG染色，醛品红染色，Ⅳ型胶原染色，层粘蛋白(Lam)染色。
　　二、组织工程皮肤器官培养及结构功能检测
　　1、组织工程皮肤器官培养:DED基底膜面朝上置于六孔板中，密度为5×105/cm2的成纤维细胞(Fb)悬液接种在DED的真皮面，过夜培养后，将DED翻转，使真皮乳头面朝上，在其上接种密度为5×106/cm2的hAECs细胞悬液，液下培养3天使hAECs融合，后将DED置于塑料支架上进行气-液面培养2周。在器官培养过程中，每3天换液一次。
　　2、组织工程皮肤结构及功能检测:透射电镜观察组织工程皮肤的超微结构。免疫组化检测:包括组织结构相关检测:广谱细胞角蛋白、波形蛋白;与细胞增殖相关的检测:Ki67抗原;与细胞分化相关的检测:CK19、CK18、CK14、CK10、丝聚合蛋白(Filaggrin);基底膜相关的检测:碘酸雪夫氏染色(PAS)、Ⅳ型胶原、层粘蛋白;细胞间连接检测:桥粒芯蛋白(desmoglein)。
　　三、组织工程皮肤修复裸鼠创面缺损
　　取3-4周大健康雄性裸鼠，随机分为2组，组织工程组，空白对照组，每组10只裸鼠。制备背部全层皮肤缺损模型。分别于术后1、2、3、4周对全身及移植部位肉眼大体观察，比较实验组与对照组间的创面愈合时间及创面愈合率，并对移植部位行组织学观察。
　　结果：
　　羊膜上皮细胞具有干细胞的特征，免疫荧光显示OCT-4、SSEA-4阳性。制备的DED已有效清除了细胞成分但保留了基底膜中层粘蛋白和Ⅳ型胶原等主要成分。体外构建的组织工程皮肤形成4-9层复层表皮，且表皮的组织结构形态与正常皮肤类似，移植裸鼠创面后能够促进创面愈合。免疫组化结果显示，构建的组织工程皮肤与正常皮肤增殖分化特征类似，Ki67，CK19，CK14，CK10，filaggrin均表达，但CK18不表达。PAS染色显示在构建的组织工程皮肤真表皮连接处可见一均质红色带。另在组织工程皮肤中可检测到基底膜成分蛋白（层粘蛋白和Ⅳ型胶原）和细胞间连接蛋白（桥粒芯蛋白）。透射电镜下可观察到构建的人工皮肤中存在桥粒、半桥粒及基底膜带等超微结构。
　　结论：
　　1、羊膜上皮细胞易于分离培养，并可在体外大量扩增，且具有干细胞的特性，是一种较为理想的组织工程皮肤种子细胞。
　　2、DED组织是富含胶原的三维结构，其表面保留基底膜部分结构及成分，是一种天然真皮替代物，在体外重建皮肤的研究中具有较高的应用价值。
　　3、羊膜上皮细胞在DED上进行器官培养可以构建出与正常皮肤结构类似的组织工程皮肤。
　　4、在DED上发育的新生表皮具有与自体皮肤相近的增殖及分化标记分子。
　　5、构建的hAECs-DED组织工程皮肤移植裸鼠背部皮肤缺损后，能够较好的修复创面，并且移植后能够在裸鼠体内存活。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 人羊膜上皮细胞的分离、培养和鉴定及人去表皮真皮的制备及其特征的研究

前言

实验材料

实验方法

结果

讨论

结论

论文二 人羊膜上皮细胞在去表皮真皮上构建组织工程皮肤及其性状研究

前言

实验材料

实验方法

结果

讨论

结论

论文三 组织工程皮肤修复裸鼠创面缺损的实验研究

前言

实验材料

实验方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述

在学期间科研成绩

致谢

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