外周血单核细胞免疫耐受在脂多糖诱导的大鼠脑内炎症反应中的作用机制研究

摘要

目的:脑内的炎症反应是许多神经系统变性病共同存在的发病机制，而帕金森病(PD)作为发病率第二的严重危害中老年人健康的神经系统变性病，包括脑内小胶质细胞的激活、前炎性因子的过度释放及细胞内活性氧(ROS)系统过度激活的脑内炎症是PD的重要病因。其中小胶质细胞是中枢神经系统免疫活动的核心，其活化后具备抗原提呈、吞噬、释放超氧离子及前炎性因子等能力，能对周围的神经元造成损伤，因而对小胶质细胞激活及脑内炎症的有效调控成为影响PD的关键。
　　尽管受到血脑屏障的保护，中枢神经系统一直受到外周免疫的深刻影响。一次大剂量LPS腹腔注射诱发的外周炎症足以引起健康中枢神经系统的免疫激活和多巴胺神经元的变性死亡。外周血单核细胞(PBM)是外周免疫的启动者，处于启动调控外周免疫的核心地位，同时外周血单核细胞与小胶质细胞同属单核巨噬细胞系统，具有相似的起源、功能及受体表达，且PBM具有变形穿越能力，它能穿越血脑屏障入脑演变成小胶质细胞或血管周巨噬细胞等脑内特殊巨噬细胞群直接或间接参与中枢炎症反应，因此不难推测PBM在外周与中枢的联系中扮演了重要角色，是外周影响中枢免疫活动的重要通路。
　　免疫耐受是机体面对持续抗原威胁或连续打击的一种保护机制，它避免了不必要损伤的发生，是机体防御机制的重要组成部分，而单核巨噬细胞系统在免疫耐受的整个过程中发挥了主要的作用。PD患者外周血中持续存在能够诱导PBM发生免疫耐受低剂量的LPS，而实际上PD患者外周血免疫细胞处于激活状态，提示PD患者可能存在PBM免疫耐受的障碍，而PBM的免疫耐受障碍的存在可能是PD患者脑内炎症失控的一个重要发病机制。CD200R是PBM表面常规表达的受体，积极参与了巨噬细胞的免疫下调，同时CD200/CD200R通路与免疫耐受密切相关。我们既往的研究结果显示PD患者外周血单核细胞衍生的巨噬细胞在应激环境中CD200/CD200R通路难以有效发挥作用。因此我们推测CD200/CD200R通路积极参与了PBM的免疫下调，CD200/CD200R通路异常可能是PD患者外周PBM免疫耐受失败的重要机制。
　　考虑到低剂量LPS能够诱导PBM发生免疫耐受，而PBM是外周免疫与中枢连接的重要中介，我们推测低剂量LPS诱导了PBM的免疫耐受，使其免疫活动下调，后者影响并限制了脑内炎症的发展，使更多神经元免于无辜的炎症损伤，从而对损伤神经元起到保护作用。而该过程中PBM免疫耐受的形成是抑制小胶质细胞活化、下调脑内炎症、保护神经元存活的关键。因此PBM的免疫耐受有可能是中枢神经系统自身保护、避免过度炎症损伤的重要外周机制。
　　方法:1、为了获得能够诱导大鼠PBM免疫耐受的合适的LPS剂量，我们采用NS、LPS0.1mg/kg、LPS0.3mg/kg、LPS0.9mg/kg剂量梯度连续4天间隔24小时腹腔注射，于第5天我们采用贴壁法得到大鼠外周血PBM并再次给予LPS100ng/ml刺激，通过刺激后细胞上清前炎性因子TNF-α、IL-1β含量及PBM表面抗原TLR4的变化情况来确定大鼠免疫状态以得到能够诱导PBM免疫耐受的合适的LPS剂量。2、我们采用大剂量LPS（5mg/kg）腹腔注射来诱导大鼠脑内炎症模型。同时为了验证PBM在外周LPS诱导脑内炎症的作用，我们采用氯膦酸二钠脂质体鼠尾静脉注射来耗竭大鼠的PBM，即PBM耗竭组。实验分为4组:正常对照组(n=15)、LPS组(n=15)、PBM免疫耐受+LPS组(n=15)、PBM耗竭+LPS组(n=15);分别对各组大鼠大剂量LPS腹腔注射后48h内的生存率进行鉴定。3、为了对PBM及PBM的免疫状态对脑内炎症的影响进行研究，分别对LPS组(n=6)、PBM免疫耐受+LPS组(n=6)、PBM耗竭+LPS组（n=6）各组予大剂量LPS注射后的2h、1d、7d对外周及中枢的免疫状态进行鉴定，包括外周血上清前炎性因子TNF-α、IL-1β含量及PBM表面抗原TLR4、CD200R的变化，脑内黑质前炎性因子TNF-α、IL-1β的含量及小胶质细胞的激活标记物CD68、MHCⅡ的表达情况及各组黑质多巴胺能神经元的存活情况。4、为了对CD200/CD200R通路在PBM免疫耐受形成中的作用进行研究，我们在体外采用以终浓度为10ng/ml的LPS的10％培养基孵育24h诱导PBM的免疫耐受并采用终浓度为5ug/ml的抗CD200R1抗体阻断CD200/CD200R通路。我们将贴壁法提取的正常大鼠的PBM分为对照组、PBM免疫耐受组(10ng/ml LPS)及PBM免疫耐受+anti-CD200R1组（10ng/ml LPS+5ug/ml anti-CD200R1抗体），分别孵育24小时后给予LPS100ng/ml再刺激4h后检测各组细胞培养上清中TNF-α及IL-1β含量，从而在体外研究该通路在PBM免疫耐受形成中的作用。
　　结果:1、低剂量LPS腹腔注射可诱导PBM的免疫耐受。大鼠0.3mg/kg LPS组连续4天腹腔注射后提取的外周血PBM再次受到LPS刺激时表现为前炎性因子TNF-α(P＜0.01)、IL-1β（P＜0.01）的含量较对照组明显下降，PBM表面TLR4的表达也明显下降(P＜0.01);而0.1mg/kg组及0.9mg/kg组前炎性因子TNF-α、IL-1β含量及TLR4的表达较对照组无显著差异。2、大剂量LPS腹腔注射后48h内大鼠生存率示:LPS组的大鼠生存率为66.67％，而正常对照组、PBM免疫耐受+LPS组、PBM耗竭+LPS组大鼠生存率为100％，PBM免疫耐受及PBM耗竭均显著提高了大剂量LPS腹腔注射后大鼠生存率(P＜0.01)，并缺少腹泻、眼角出血等全身炎症表现。3、PBM免疫耐受及免疫耗竭抑制大剂量LPS腹腔注射诱导的外周炎症反应。表现为PBM免疫耐受+LPS组、PBM耗竭+LPS组在大剂量LPS腹腔注射后2h、1d、7d时血清前炎性因子TNF-α、IL-1β的含量均显著低于LPS组，PBM免疫耐受+LPS组的TLR4的表达在1d时也显著低于LPS组(P＜0.05)，7d时TLR4表达量差异无显著性(P＞0.05)。4、PBM免疫耐受及免疫耗竭抑制大剂量LPS腹腔注射诱发的脑内炎症反应。表现为大剂量LPS腹腔注射后2h、1d、7d时PBM免疫耐受+LPS组、PBM耗竭+LPS组脑内黑质前炎性因子TNF-α、IL-1β含量及小胶质细胞的激活标记物CD68、MHCⅡ的表达均显著低于LPS组，差异有统计学意义(P＜0.05)。5、大剂量LPS腹腔注射后7d时正常对照组、LPS组、PBM免疫耐受+LPS组及PBM耗竭+LPS组各组黑质多巴胺能神经元数量差异无显著性(P＞0.05)，各组均未观察到多巴胺能神经元的死亡。6、PBM免疫耐受通过上调细胞表面的CD200R的表达量来抑制过度炎症反应，PBM免疫耐受+LPS组在大剂量LPS腹腔注射后1d时PBM表面CD200R表达量显著高于LPS组(P＜0.05)，7d时CD200R的表达无显著差异(P＞0.05)。7、CD200/CD200R通路为诱导PBM免疫耐受所必需，体外阻断CD200/CD200R1通路后PBM再次受到LPS刺激后细胞上清前炎性因子TNF-α、IL-1β的含量明显高于PBM免疫耐受组(P＜0.05)，而与对照组相比无显著差异(P＞0.05)。
　　结论:1、低剂量LPS腹腔注射能诱导大鼠PBM免疫耐受。2、PBM为外周大剂量LPS诱导脑内炎症所必需，是外周免疫影响中枢免疫的一个重要途径。3、PBM免疫耐受能通过上调细胞表面CD200R的表达来抑制脑内过度炎症反应，对外周PBM的有效调控可能是解决脑内炎症的一种潜在方法。4、CD200/CD200R通路为诱导PBM免疫耐受所必需。

目录

声明

摘要

英文缩略语

第一部分：外周血单核细胞免疫耐受减轻外周大剂量LPS所致大鼠中枢神经系统炎症反应

1 前言

2．1 研究对象和分组

2．2 主要试剂和仪器

2．3 实验方法

2．4 统计学分析

3 结果

3．2 大鼠外周LPS0．3mg／kg腹腔注射能够抑制PBM LPS再刺激后TLR4的表达

3．3 外周PBM免疫耐受及PBM耗竭提高了大鼠大剂量LPS腹腔注射后的生存率

3．4 PBM免疫耐受预处理能够抑制大剂量LPS腹腔注射后血上清前炎性因子的产生

3．5 PBM免疫耐受预处理能够抑制大剂量LPS腹腔注射后PBM表面TLR4的表达

3．6 PBM免疫耐受预处理能够减少外周大剂量LPS导致的SN内前炎性因子的含量

3．7 PBM免疫耐受预处理能够减少外周大剂量LPS导致的SN内小胶质细胞的激活

4 讨论

第二部分：PBM免疫耐受形成及其抑制脑内炎症反应的机制研究

5 前言

6．1 研究对象和分组

6．2 主要试剂和仪器

6．3 实验方法

6．4 统计学分析

7 实验结果

7．3 PBM免疫耐受预处理未对大剂量LPS腹腔注射后黑质多巴胺能神经元数量产生影响

8 讨论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 外周血单核细胞免疫耐受障碍对脑内慢性炎症的影响及与帕金森病关系的研究进展

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简历