新型TBV候选抗原PSOP26的免疫活性及效应分析

摘要

目的:截至目前，疟疾仍然是具有严重临床症状的疟原虫感染性疾病。据2016年疟疾报告所述，2015年全世界有2.12亿疟疾新病例和42.9万例疟疾死亡病例。特别是在非洲等发展中国家，疟疾仍然是5岁以下儿童死亡的主要原因。近些年临床上疟疾治疗药物氯喹和青蒿素的联合应用，使疟疾得到有效的控制。然而，仍然有将近40％的世界人口受到间日疟威胁，每年引起130多万例临床感染。随着疟原虫对一些抗疟药耐药性的反复出现和按蚊对于杀虫剂的抵抗性，研发有效的疟疾疫苗是重要且难以攻克的课题。目前疟疾疫苗可分为三种分别是:子孢子疫苗、肝期疫苗、红内期疫苗和传播阻断疫苗。传播阻断疫苗(Transmission-blocking vaccines TBVs)虽然不能直接阻止疟原虫的感染，但能够阻止疟原虫通过媒介按蚊从感染者到未感染者的传播从而阻断疟疾在人类宿主和蚊子之间的传播并且其候选抗原主要表达于蚊阶段的虫体表面，机体产生抗体后阻断蚊胃中疟原虫的发展进而切断疟原虫的传播。
　　疟疾传播阻断疫苗的基本原理是用疟原虫在蚊阶段的表面抗原免疫个体，引起机体免疫应答产生抗体，干扰疟原虫在蚊体内的后续发育周期，改变疟原虫在蚊体内的生活循环，从而切断疟疾的传播。疟疾的传播最主要在于按蚊成功摄取含有雌雄配子体的患者外周血液。在蚊体内的中肠部位，雌雄配子体受精变为合子。合子经过受精后变为具有运动能力的动合子，动合子进入中肠上皮发育成卵囊。大量的研究已经证实天然产生和疫苗诱导的抗体在血液中被摄入到蚊体内后，能够抑制配子体在蚊子中肠部位的发育阶段（受精，动合子和卵囊的发育），进一步阻碍疟原虫生活史的完成。传播阻断疫苗目的在于干扰疟原虫在蚊体内的有性生殖阶段。尽管传播阻断疫苗在疟疾控制中有至关重要的作用，但研究进展依然缓慢，能够完全阻止疟传播的高效疫苗还没有研究出来，因此亟需加强这方面的研究。迄今为止，仅有一少部分候选蛋白显示出较好的传播阻断活性，包括表达于配子体与配子阶段的P48/45和P230，表达于合子与动合子阶段的P25/P28以及表达于蚊阶段的HAP2等，但是其临床效果很难达到控制和消除疟疾的目的，所以完成消灭疟疾的目标任重而道远。因此，我们认为仍要发现跟多的新的传播阻断候选抗原进而研制高效并且经济实惠的抗疟疫苗，才是消灭疟疾的根本可行的方法。
　　我们使用良好的特性和更易于操控的鼠疟-伯氏疟原虫(Plasmodium bergheiANKA)做初步筛选。通过生物信息学分析疟原虫数据库并从中主要选择在有性生殖阶段表达的膜表面蛋白PBANKA_145770(PSOP26)，截取其优势抗原表位区部分，通过直接免疫重组蛋白后的血清抗体来进行验证、评价所选蛋白的抗原性和免疫原性，通过免疫学实验技术确定PSOP26在伯氏疟原虫表达的位置。为了发掘出PSOP26的基因功能，运用基因重组技术敲除伯氏疟原虫基因组中的PSOP26，并探究其在蚊体内对疟原虫发育的影响。通过以上所提出的实验方案，来评定TBVs候选抗原是否具有较高传播阻断效果，能否成为优秀的传播阻断疫苗的候选抗原，为人体疟疾疫苗的研制和开发提供新的理论基础和实验依据。
　　研究方法:1、传播阻断疫苗候选蛋白的生物信息学分析。在疟原虫数据库PlasmoDB选取候选基因后BLAST进行基因序列的比对，根据SMART排除信号肽和结构域的部分，再用ClustalW对其多重序列比对，最后用MAGA5做进化树分析，确定了1种有性阶高度保守的疟原虫膜蛋白，PBANKA_145770(POSP26)，DNA长为1065bp，蛋白分子量为42614Da，含有一个信号肽及多个跨膜域和多个低复杂区。
　　2、设计和构建候选蛋白的原核表达载体。6-8周龄，雌性BALB/c小鼠经腹腔感染分别感染5×106 Plasmodium berghei ANKA寄生红细胞，配子体多的第四天并提取小鼠含全虫血的基因组DNA。根据原核表达载体的生物学特点设计引物，以DNA为模板扩增基因片段，将克隆后的产物通过T4连接酶连接到载体pET32a(+)中，再将原核表达载体转化到Escherichia coli表达的菌株BL-21中，选择阳性菌落并通过PCR技术确定大小后送生物技术公司测序鉴定。
　　3、重组蛋白的表达与纯化。将正确构建的带有His标签的PSOP26转入Escherichia col表达的菌株BL-21中，选择阳性克隆菌落并在Luria-Bertani液体培养基中经过蛋白诱导剂IPTG诱导后大量表达，然后通过SDS-PAGE电泳法确定其正确性后，在利用亲和层析法纯化r PSOP26重组蛋白并确定浓度。
　　4、实验动物处理和血清制备。重组蛋白免疫:BALB/c（6～8周龄，雌性），随机分为实验组对照组各十只。实验组给予重组蛋白（50μg/小鼠）与弗氏完全佐剂混合，免疫小鼠。每两周再次进行一次加强免疫。对照组在相同时间给予相同剂量。留取血清:于第一次免疫后的14，28，42天，将血收集并留血清置于-80℃冰箱保存。
　　5、免疫血清抗体滴度检测-ELISA。将PBS稀释的8μg/ml重组蛋白包被酶标板每个孔100μl，4℃冰箱保存12小时，再用200μl含1％BSA的PBS，37℃恒温封闭1小时，PBS洗3次后每孔加入倍比稀释不同免疫时间段小鼠血清100μl，37℃温箱2小时，PBST（含0.1％Tween20）洗3次，加入1∶5000稀释的HRP偶联的羊抗鼠IgG，37℃温箱1小时，PBST洗3次，最后加入邻苯二胺和过氧化氢并显色，50μl H28O4终止反应后在酶标仪检测OD490nm数值。
　　6、制备不同阶段Plasmodium berghei ANKA的虫抗原。裂殖体:含5×106个Plasmodium berghei ANKA感染6-8周龄BALB/c约第十二天的感染率达到5～10％后用4％水合氯醛麻醉小鼠，眼球取血，过CF11粉末柱去除白细胞，培养基稀释的55％(V/V) Nycodenz密度梯度离心分离，25℃，2000rpm，20分钟，缓慢吸取中间灰白层裂殖体。配子体:感染4天后，连续2天给小鼠添加含有磺胺嘧啶的饮用水。第6天的血液只含有丰富的配子体，培养基稀释的48％(V/V)Nycodenz进行密度梯度离心分离，37℃，2000rpm离心20分钟，收集中间灰白层配子体。动合子:小鼠感染第3天，心脏采血，混合血液与动合子培养基(RPMI1640，50mg/l青霉素，50 mg/l链霉素，20％(v/v)胎牛血清，15U/ml）比例为1∶9，经CF11粉末柱去除白细胞。19℃恒温培养24小时，吉姆萨染色检查有无成熟的动合子形成，若有则收集上清，62％(v/v)Nycodenz密度梯度离心分离，25℃，2000rpm离心20分钟，缓慢吸取中间灰白层动合子，PBS清洗3次，取少许均匀铺在玻片上，吉姆萨染色检查纯化效果，-80℃冻存。
　　7、Western-blot。每孔加入50μg蛋白分别为重组蛋白和提纯的不同阶段疟原虫抗原，在含有12％分离胶，5％浓缩胶的SDS-PAGE中分离，一般采用恒压浓缩胶50v，60分钟，分离胶80v，100分钟左右条件。电泳至分离胶下缘，可以结束电泳。然后电压60v转膜100分钟，用5％脱脂奶封闭2小时后加入免疫后小鼠血清（1∶20倍稀释），4℃摇晃孵育过夜。膜被1×TBST清洗三次每次10分钟，然后1∶6000倍稀释的辣根过氧化物酶耦合的二抗，25℃，匀速摇晃1小时，1×TBST洗膜4次每次10分钟，应用HRP-ECL发光法发光并成像。
　　8、间接免疫荧光(IFA)。不同阶段的疟原虫（裂殖体、配子体，以及动合子）血液混合液1μl均匀平铺在荧光片上，4％多聚甲醛室温固定20分钟然后用10％ BSA（PBST配制）37℃温育30分钟，PBST冲洗后加入免疫后血清(1:50稀释)和抗Pbs21阳性对照（1:500稀释），37℃孵育60分钟后PBST室温洗3次每次5分钟。然后加入FITC标记的羊抗鼠抗体（1∶500稀释）在37℃恒温结合60分钟，PBST室温洗3次每次10分钟，最后DAPI染核，50μl室温静置5分钟后用封片剂封片，荧光显微镜下观察。
　　9、免疫血清对传播阻断效果的评估。动合子转换率比较:在体外，将重组蛋白/PBS免疫的小鼠血清用正常小鼠血清以行1∶10进稀释。5×106含有Plasmodium berghei ANKA寄生的红细胞感染小鼠后第4天收集感染小鼠血液10μl置于90μl动合子培养基中。实验组和对照组19℃培养24小时。用抗Pbs21抗体来固定和标记培养物，在荧光显微镜下观察实验组和对照组动合子各阶段比例。在体内，用重组蛋白和PBS免疫小鼠，十天后实验组和对照组分别腹腔注射5×106个Plasmodium berghei ANKA寄生的红细胞。感染后第3天，30只雌按蚊叮咬用4％多聚甲醛麻醉的小鼠1小时。10天后解剖蚊子比较蚊胃中卵囊数量。
　　10、△PSOP26疟原虫的构建。△PSOP26质粒是英国PlasmoGEM机构提供，ID为PbGEM-080757 lasmoGEM官网:http://plasmogem.sanger.ac.uk/。构建成功的质粒用NOTⅠ电转染仪转到纯度70％～80％的裂殖体中，将150μl红细胞混合液通过尾静脉注射到小鼠体内，经过一天的红内期循环后给予含有五氟尿嘧啶的饮用水连续三天进行阳性筛选。眼球取血红细胞感染率达3％左右小鼠5只用PCR进行基因型鉴定。然后选择阳性疟原虫，用生理盐水稀释至1ml含有5个疟原虫，每只小鼠尾静脉注射100μl，PCR鉴定从而获取基因型一致疟原虫。
　　11、△PSOP26与野生型(WT)疟原虫基因功能比较。BALB/c（6～8周龄，雌性），随机分为实验组对照组，各6只，分别感染5×106个基因敲除型和野生型疟原虫。感染率和生存率比较:感后第3天吉姆萨染色开始计数感染率，雌雄配子体比例，数量。在体外比较动合子不同阶段数量及配子体出丝情况:取10μl血液置于90μ l动合子培养液中，疟原虫在19℃恒温培养24小时后，用抗Pbs21和羊抗鼠IgG(FITC标记)混合物，用荧光显微镜下观察动合子数量的差异。同时取小鼠尾静脉10μl血液加入到90μl动合子培养基中，25℃恒温培养15分钟，并在10分钟内完成配子出丝数的计数。在体内蚊胃内卵囊数量比较:用△PSOP26和WT疟原虫感染小鼠分别为实验组和对照组，感染后第3天，麻醉的感染小鼠并喂养30只按蚊1小时。24小时后取蚊子血液荧光片观察动合子形成各阶段的数量比较，十天后解剖蚊子来计算蚊胃中卵囊数量。实验结果采用T-text检验进行统计分析。
　　12、统计分析。应用GraphPad Prism6.0和SPSS version17.0统计软件对数据进行处理和统计， P＜0.05表示差异有显著统计学意义。
　　结果:1、成功克隆并表达和纯化PSOP26。我们成功构建pET32a(+)-PSOP26，并转化到Escherichia coli表达菌株BL-21，大量重组蛋白用Western blot电泳分析正确后，His-tag镍氨三乙酸琼脂糖柱纯化重组蛋白。最后可使得重组蛋白浓度到达0.6mg/ml。
　　2、免疫血清的免疫原性评价。跟对照组比较，三次免疫后的血清抗体均有强免疫应答，且有明显的区别。
　　3、rPSOP26表达位置确定。Western blot:纯化后的rPSOP26得到的抗血清可与纯化后的动合子特异性结合。IFA:实验组在荧光显微镜下可见带有绿色荧光标记的动合子，与阳性对照组一致。
　　4、动合子形成各阶段转换率及卵囊数量。体外:实验组跟对照组相比较，动合子阶段的macrogamete、round、retort、数量无明显变化但动合子转换率降低显著。体内:rPSOP26免疫后的小鼠被蚊子叮咬，十天后解剖蚊胃，实验组中卵囊数是对照组的一半。
　　5、△PSOP26型疟原虫虫株制备。从英国PlasmoGEM获得的质粒，通过电转仪输入到疟原虫裂殖体内，通过乙胺嘧啶阳性选择出耐药功能的疟原虫后，利用PCR鉴定并得到了基因敲除型的疟原虫株△PSOP26。
　　6、△PSOP26型疟原虫与WT疟原虫基因功能的比较。△PSOP26与WT相比，疟原虫红细胞感染率及生存期无差别。配子体数量无显著变化，雄雌配子体比例有减少的趋势但无统计学意义。动合子体内外的转换率均分别下降55％和60％，配子体出丝数无明显统计学意义，蚊子胃中的卵囊数量急剧减少降低了200倍。
　　结论:
　　1、正确构建，纯化和表达PSOP26。
　　2、rPSOP26免疫小鼠后的免疫血清具有优秀的免疫原性和高效的抗原性。
　　3、rPSOP26主要表达于动合子表面。
　　4、rPSOP26的免疫血清可以抑制疟原虫有性阶段的动合子形成并减少蚊胃卵囊数量。
　　5、成功筛选△PSOP26型疟原虫虫株。
　　6、△PSOP26与WT比较，小鼠的红细胞感染率和生存率无根本差别;雄雌配子体比例和总配子体数量无明显差别。实验组的动合子形成数量和蚊胃中的卵囊数量显著降低。PSOP26可作为新的TBV候选抗原。

目录

声明

摘要

英文缩略语

第一部分：TBV候选抗原PSOP26表达阶段及传播阻断能力的确定

1 前言

2．1 主要仪器和试剂

2．2 实验方法

3．1 PSOP26生物信息学分析

3．2 PSOP26克隆和蛋白表达

3．3 rPSOP26血清学分析

3．4 提纯不同阶段Plasmodium berghei ANKA的虫抗原

3．5 Western Blot确定PSOP26表达阶段

3．6 IFA确定PSOP26表达阶段

3．7 rPSOP26传播阻断效应评估

4 讨论

5 结论

第二部分：ΔPSOP26疟原虫的生物学功能研究

6 前言

7 材料和方法

7．1 主要仪器和试剂

7．2 实验方法

8 结果

8．1 PSOP26基因与同源虫株保守性分析

8．3 ΔPSOP26型疟原虫阳性筛选

8．4 ΔPSOP26和WT型疟原虫无性血液阶段毒力比较

8．5 ΔPSOP26和WT型疟原虫有性蚊体阶段的发育区别

9 讨论

10 结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 疟疾传播阻断疫苗的效应及研究进展

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简介