Fgf9在正常和肛门直肠畸形胎鼠直肠发育过程中时空表达的研究

摘要

目的:
　　探讨成纤维细胞生长因子9(Fibroblast growth factor, Fgf9)在正常及肛门直肠畸形(anorectal malformation，ARM)大鼠胚胎后肠发育过程中的时空表达情况，并分析其在胚胎肛门直肠发育及ARM的发病机制中可能发挥的作用。
　　研究方法:
　　将显微镜下涂片发现精子的雌鼠视为孕鼠，随机将孕鼠分成两个组:乙烯硫脲(Ethylenethiourea，ETU)处理组以及对照组。在胚胎(embryonic day，E)生长第10天时，ETU处理组根据125mg/Kg的剂量给予大鼠1％ ETU，对照组给予同等剂量的生理盐水。两组孕鼠分别在胚胎生长E13～E16天时行剖宫取胎术，其中整个胚胎经4％多聚甲醛固定24～36小时后，经二甲苯及梯度酒精常规脱水，石蜡包埋行3.5μm正中矢状面连续切片以备免疫组织化学染色用。此外制备胚胎冰冻切片，于冰冻切片机上连续矢状位切片，手工分离泄殖腔及直肠部分，准备提取组织蛋白及mRNA，应用Western blot和qRT-PCR检测Fgf9在正常及ARM胚胎的蛋白及mRNA的表达水平。
　　结果:
　　Fgf9免疫组织化学染色结果显示，正常组:第13天时，Fgf9阳性细胞广泛分布于尿直肠隔间质和后肠间质，其后肠上皮层也有一定数量的阳性细胞。第14天时，Fgf9阳性细胞仍主要分布于尿直肠隔间质和后肠间质，后肠上皮有少量表达，泄殖腔膜处也可见阳性细胞表达。第15天时，尿直肠隔与泄殖腔膜的融合部分有较多的阳性细胞表达，结直肠上皮阳性细胞明显增多、呈强阳性反应，尤其是直肠末端上皮及肛膜处。此期，泄殖腔Fgf9的免疫反应强度几乎达到顶峰。第16天时，在结直肠上皮和尿直肠隔与泄殖腔膜融合处仍可见免疫阳性细胞，但其免疫反应强度较15天时明显下降。ARM组:在泄殖腔间质如尿直肠隔、后肠间质和结肠、直肠上皮处仅有少量Fgf9阳性细胞表达。Westernblot结果显示，正常组第13天，第14天和第15天Fgf9的表达量均高于ARM组，特别是在肛门形成的关键即第14天和第15天，正常组Fgf9的表达量几乎达到顶峰，而在ARM组表达量明显下降。（E13，1.45±0.03（正常组）vs.1.13±0.09（畸形组）;E14，1.65±0.12（正常组）vs.1.18±0.10（畸形组）;E15，1.92±0.18（正常组）vs.1.48±0.01（畸形组）;p＜0.05，差异具有统计学意义）。第16天时，正常组和ARM组均可见Fgf9表达开始减弱。（E16，1.25±0.07（正常组）vs.1.11±0.02（畸形组）;p＞0.05，二组无统计学差异）。qRT-PCR结果显示，ARM组Fgf9的mRNA表达量在第13～15天较正常组降低，差异具有统计学意义(p＜0.05)。
　　结论:
　　在正常大鼠胚胎的泄殖腔和肛门直肠发育过程中，不同时期不同部位Fgf9的表达量存在差异，在该过程中，Fgf9可能发挥了重要的作用。ETU致畸的大鼠胚胎期泄殖腔和后肠Fgf9表达下调可能与ARM的发生有关。

目录

声明

摘要

英文缩略语

1 前言

2．1 实验动物、试剂和仪器

2．1．1 实验动物

2．1．2 主要试剂

2．1．3 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 动物模型的制作及标本制备

2．2．2 免疫组织化学染色

2．2．3 Western blot蛋白印迹

2．2．4 qRT-PCR测定

3．1 大体所见

3．2 免疫组织化学染色结果

3．3 Western blot结果

3．4 qRT-PCR结果

4 讨论

5 结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 Fgf家族相关基因与消化道发育及肛门直肠畸形形成的关系

致谢

个人简历