同型半胱氨酸在先天性心脏病中调节cMyBP-C和NKX2.5表达的作用机制研究

摘要

目的:先天性心脏病（Congenital heart disease，CHD）是引起胎儿死亡的主要出生缺陷之一，主要由于胎儿心脏在发育过程中受到干扰，使部分发育停顿或缺陷，以及部分本该退化者未能完全退化所致。同型半胱氨酸是必需氨基酸——甲硫氨酸的中间代谢产物，其代谢异常是导致先天性心脏病的环境危险因素之一。同型半胱氨酸的主要代谢途径之一是再甲基化为甲硫氨酸，而这一过程需要叶酸提供甲基，维生素B12作为辅酶，因此叶酸缺乏或代谢异常是影响同型半胱氨酸水平的主要因素。同型半胱氨酸具有细胞毒性，可使巯基氧化而产生自由基，引起DNA损伤和细胞凋亡。在孕有先天性心脏病胎儿的孕妇中发现其血浆中同型半胱氨酸水平明显增高。除此之外，在动物模型中也发现，同型半胱氨酸浓度的增加，使胚胎生长发育迟缓，同时伴有先天性心脏畸形。
　　心肌肌球蛋白结合蛋白C(cardiac myosin binding protein C，cMyBP-C)是一个在横纹肌粗肌丝中特定表达的结构蛋白，并参与肌节的形成和心脏功能的调节，其低表达可引起心肌结构的改变而导致心肌扩张及心脏衰竭。该基因的突变是肥厚型心肌病的主要致病原因之一。胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors，IGFs)信号通路在胎儿生长发育过程中起着至关重要的作用，胰岛素样生长因子结合蛋白5（Insulin-like growth factor-binding protein-5，IGFBP5）是IGFs家族的重要成员，与心脏的发育密切相关。NK2 homeobox5(NKX2.5)是心脏特异转录因子，与心脏的形成和发育密切相关。动物实验表明，Nkx2.5基因的低表达会导致心脏传导阻滞和房间隔缺损等心脏发育异常。同时，在先天性心脏病患者中也发现了NKX2.5基因突变及表达异常。
　　为了探讨同型半胱氨酸对心脏发育的影响，本研究首先鉴定先天性心脏病胎儿的羊水中cMyBP-C和NKX2.5的表达情况。其次，以同型半胱氨酸为刺激因素作用于大鼠胎鼠心肌细胞，鉴定Mybpc和Nkx2.5基因的表达情况，并进一步验证同型半胱氨酸调控Mybpc和Nkx2.5表达的具体机制。
　　研究方法:1、标本:本研究已收集的先天性心脏病及对照标本均已签署知情同意书，并经医学伦理委员会审查批准通过。本实验所用标本均由中国医科大学盛京医院提供。所有先天性心脏病胎儿均经超声确诊。2、提取羊水总蛋白并定量，Western blot检测cMyBP-C、KLHL3、IGFBP5和NKX2.5蛋白表达。3、同型半胱氨酸刺激心肌细胞H9C2细胞，Real-time PCR检测H9C2细胞Mybpc3、Klhl3、Igfbp5及Nkx2.5基因mRNA表达情况，Western blot检测各蛋白表达水平。4、干扰Klhl3后，Western blot观察H9C2细胞cMyBP-C蛋白表达水平变化。5、免疫共沉淀检测cMyBP-C与泛素标签的相互作用;使用免疫荧光共聚焦及免疫共沉淀两种方法验证cMyBP-C与泛素连接酶E3 KLHL3的相互结合。6、MG132刺激H9C2细胞24 h后，Western blot检测H9C2细胞中cMyBP-C蛋白变化。7、干扰Mybpc3后，应用流式细胞术分析H9C2细胞凋亡指标。8、过表达IGFBP5后，Real-time PCR和Western blot检测Nkx2.5基因的表达情况。9、利用生物信息学软件AliBaba2.1和JASPAR分析大鼠Nkx2.5基因启动子结构，应用PCR克隆技术构建Nkx2.5基因启动子区萤光素酶报告基因载体及突变载体，通过双萤光素酶报告基因检测IGFBP5对其启动子区活性的调控作用。10、ChIP和EMSA实验进一步在体内、体外条件下验证IGFBP5与Nkx2.5基因启动子区的结合。
　　结果:1、KLHL3参与同型半胱氨酸经泛素蛋白酶体调节cMyBP-C表达的机制研究。(1)与正常对照胎儿羊水相比，先天性心脏病胎儿羊水中cMyBP-C蛋白表达水平下降，KLHL3蛋白表达水平上升。(2)同型半胱氨酸刺激心肌细胞H9C2细胞后，Mybpc3基因mRNA表达略微上升，cMyBP-C蛋白表达水平下降，提示同型半胱氨酸诱导cMyBP-C可能发生翻译后修饰;同时检测Klhl3基因，发现该基因mRNA及蛋白表达水平均显著上升。(3)siRNA干扰Klhl3表达后，H9C2细胞cMyBP-C蛋白表达水平增高。(4)免疫共沉淀结果显示，cMyBP-C蛋白发生泛素化修饰;免疫荧光共聚焦提示KLHL3蛋白可能是介导cMyBP-C蛋白泛素化修饰的泛素连接酶E3。(5)蛋白酶体活性抑制剂MG132恢复了同型半胱氨酸导致的cMyBP-C蛋白的减少。说明同型半胱氨酸诱导cMyBP-C蛋白经由泛素-蛋白酶体途径降解。(6)干扰Mybpc3基因表达后，与同型半胱氨酸共同作用增加心肌细胞凋亡率。2、同型半胱氨酸介导IGFBP5调节Nkx2.5转录的机制研究。(1)与正常对照胎儿羊水相比，先天性心脏病胎儿羊水中NKX2.5蛋白表达水平下降，IGFBP5蛋白表达水平上升。(2)同型半胱氨酸刺激心肌细胞H9C2细胞，Nkx2.5基因mRNA和蛋白表达水平均显著下降，Igfbp5基因mRNA和蛋白表达水平均显著升高。(3)过表达IGFBP5后，Real-timePCR和Western blot检测发现Nkx2.5基因mRNA和蛋白表达水平均显著下降，说明IGFBP5对Nkx2.5起负调控作用。(4)双萤光素酶报告基因系统结果显示，Nkx2.5基因启动子区截短的系列载体中p388-1uc活性最强，且IGFBP5过表达后，其活性降低;Nkx2.5基因启动子区p388-1uc突变载体活性下降，且IGFBP5过表达后，其活性未改变。(5)通过ChIP实验进一步在体内条件下验证IGFBP5结合于Nkx2.5基因启动子区-388～-144区间。(6)通过EMSA方法在体外鉴定了Nkx2.5基因的启动子区存在可以与IGFBP5结合的反应元件。
　　结论:1、同型半胱氨酸通过泛素连接酶E3 KLHL3诱导心肌结构蛋白cMyBP-C发生泛素化修饰，并通过蛋白酶体系统降解。2、IGFBP5作为转录因子介导同型半胱氨酸负调控Nkx2.5基因转录。

目录

声明

摘要

英文缩略语

第一部分：KLHL3参与同型半胱氨酸经泛素-蛋白酶体系统调节cMyBP-C表达的机制研究

1 前言

2．1 主要试剂和仪器

2．2 实验方法

3 实验结果

3．2 心肌细胞中Hcy对Mybpc3基因表达的影响

3．3 cMyBP-C蛋白发生泛素化修饰

3．4 KLHL3介导cMyBP-C蛋白泛素化

3．5 Mybpc3基因抑制与Hcy共同诱导细胞凋亡

4 讨论

5 结论

第二部分：IGFBP5参与心脏中同型半胱氨酸抑制Nkx2．5基因表达的机制研究

6 前言

7．1 主要试剂和仪器

7．2 实验方法

8 实验结果

8．1 先天性心脏病中IGFBP5和NKX2．5的表达水平

8．2 Hcy对大鼠胎鼠心肌细胞H9C2中Igfbp5和Nkx2．5表达水平的影晌

8．3 IGFBP5抑制Nkx2．5基因的表达

8．4 IGFBP5对Nkx2．5启动子转录活性的影响

8．5 IGFBP5结合于Nkx2．5启动子区

9 讨论

10 结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 环境危险因素与先天性心脏病的研究进展

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简介