巴豆醛对肺泡液体清除率的作用及机制研究

摘要

目的:由某些因素诱发的肺内组织液的生成和回流平衡失调，使大量组织液异常积聚，从而形成肺水肿，进而造成肺通气与肺换气功能严重障碍。肺泡液体清除率(alveolar fluid clearance，AFC)对肺脏病理状态下的液体平衡，如急性肺损伤（acute lung injury，ALI）和急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)等均起重要的调控作用。位于肺泡Ⅱ型细胞项膜侧的上皮钠通道(epithelialsodium channels，ENaC)负责大部分Na+的跨膜转运，同时是肺泡水肿液的清除和ALI恢复的必要方式。有研究表明ARDS与吸烟之间的关系，可能与影响ENaC的结构和功能有关，而香烟烟雾提取物以及环境中普遍存在的一种剧毒性成分巴豆醛对呼吸系统健康也存在不利影响，并且能诱导人患ARDS。因此，我们推测巴豆醛可能是通过改变ENaC的功能影响呼吸系统健康。本课题旨在探讨巴豆醛与AFC的关系，确定其能否影响Na+的跨膜转运并探讨相关作用机制。
　　研究方法:1、通过测定经气管插管向麻醉小鼠肺泡内注入的5％小牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)溶液的重吸收率，确定巴豆醛对在体小鼠AFC的影响。2、采用尤斯灌流（Ussing chamber）技术分析巴豆醛对人肺远端上皮细胞系NCl-H441单层细胞短路电流(short-circuit currents，Isc)的影响。3、用荧光定量聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)以及使用蛋白免疫印迹(Western blot)实验确定巴豆醛对H441细胞ENaC在mRNA和蛋白水平的影响。4使用Western blot实验技术研究巴豆醛对细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinases1/2，ERK1/2)磷酸化的影响。5、用活性氧(reactive oxygen species，ROS)检测试剂盒检测巴豆醛对细胞内ROS水平的影响。
　　结果:1、巴豆醛能够明显抑制在体小鼠的AFC，与ENaC的特异性阻断剂阿米洛利作用相似。2、巴豆醛能够剂量依赖性的抑制H441细胞阿米洛利敏感型电流，表明巴豆醛能够剂量依赖性的抑制ENaC相关的活性。3、巴豆醛能够同时在蛋白和转录水平上抑制α-和γ-ENaC的表达水平。4、巴豆醛处理H441细胞30 min时能够显著增加ERK1/2蛋白磷酸化水平，且呈现时间依赖性增加。使用丝裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase，MAPKK)抑制剂PD98059预处理30 min，结果显示由巴豆醛诱导的ERK1/2磷酸化作用被抑制。同时PD98059能逆转由巴豆醛所降低的AFC。5、ROS水平随着巴豆醛刺激时间的延长而增加，与对照组相比，处理时间为8h和24 h均有显著差异，应用ROS抑制剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)能够逆转巴豆醛诱发的ROS水平升高现象。
　　结论:巴豆醛在短时间内可以通过增强ERK1/2磷酸化而减弱ENaC活性;长期暴露于巴豆醛能够降低α-和γ-ENaC的转录和翻译水平，并增加细胞内ROS产物的水平。这些研究结果使我们对巴豆醛诱导水肿型ALI的作用机制有了更深一步的了解。

目录

声明

摘要

英文缩略语

1 前言

2．1 材料

2．1．1 动物和细胞

2．1．2 试剂

2．1．4 主要溶液配置

2．2 实验方法

2．2．2 细胞培养

2．2．3 Ussing Chamber实验

2．2．4 Western Blot分析

2．2．5 RT-PCR分析

2．2．6 H441细胞内ROS水平的检测

2．2．7 统计学分析

3 实验结果

3．1 巴豆醛对小鼠AFC的作用

3．2 巴豆醛影响H441单层细胞短路电流

3．4 巴豆醛影响α-ENaC和γ-ENaC mRNA水平的表达

3．5 巴豆醛对ERK1／2磷酸化的作用

3．6 巴豆醛对H441细胞内ROS水平的作用

3．7 ERK1／2磷酸化影响巴豆醛对在体小鼠AFC的作用

3．8 巴豆醛对肺泡液体转运影响的相关机制

4 讨论

5 结论

本研究的创新性的自我评价

参考文献

综述

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简历