条件敲除小鼠Smad4基因对结膜杯状细胞发育的影响

摘要

目的:Smad4基因在眼发育过程中具有重要作用，其缺失或突变会造成严重的眼发育缺陷。已有研究表明条件性敲除小鼠表面外胚层上的Smad4基因会引起严重的小眼畸形，先天性白内障，视网膜发育缺陷和泪腺发育不良等。Smad4基因的缺失也会影响小鼠眼表的正常发育，使胚胎期小鼠眼睑闭合失败，出现出生时眼睑开放畸形。正常的结膜组织中存在大量的杯状细胞，杯状细胞质和量的异常与许多眼表疾病密切相关。杯状细胞的正常发育涉及多条信号通路，其中TGF-β超家族的信号通路也涉及其中。本实验应用Cre-LoxP系统条件敲除小鼠表面外胚层的Smad4基因，探讨Smad4基因在结膜杯状细胞发育过程中的作用。
　　研究方法:本研究通过PCR的方法选取基因型为Le-Cre Smad4flox/flox（Smad4-cKO）的小鼠为实验组，同窝同龄的Smad4flox/flox(Control)小鼠为对照组。分别选取P0，P7，P9-P14，P16，P18，P20和1M这11个天数的小鼠进行实验研究。通过HE染色观察实验组和对照组小鼠眼发育情况。使用AB-PAS染色观察结膜杯状细胞的发育情况。使用Tunel法检测实验组和对照组小鼠角结膜细胞的凋亡情况。通过Real-time PCR实验分别检测实验组和对照组小鼠P8和P20两个天数的结膜组织中，与杯状细胞发育相关的的Spdef和Foxa3基因的表达情况，结果用公式RQ=2-△△CT进行计算与分析。实验数据使用spss2.0软件进行统计学分析。
　　结果:通过HE染色观察发现，Smad4基因的缺失严重影响小鼠的眼发育，实验组小鼠出现出生时眼睑开放畸形，严重的晶状体空泡和视网膜与晶状体粘连。对照组的野生型小鼠在出生时上下眼睑呈闭合状态，直到P13上下眼睑分离。通过AB-PAS染色发现，对照组的野生型小鼠在P9出现结膜杯状细胞，但细胞数量少，体积小。随着天数的增加，结膜杯状细胞的数量逐渐增多，至P13睁眼后结膜杯状细胞体积增大，至P20基本达到成熟水平。条件敲除Smad4基因后的实验组小鼠在P12才发现结膜杯状细胞，且其数量明显少于同窝同龄的对照组小鼠。P12-1M期间的实验组小鼠结膜杯状细胞无明显增加趋势，且数量皆明显少于同窝同龄的对照组小鼠。通过Tunel法检测到，与对照组相比，实验组小鼠P14和P20两天角膜和结膜细胞的凋亡明显增多，其差异有统计学意义。Real-time PCR检测结果显示，与对照组小鼠结膜组织相比，P8和P20两天实验组小鼠结膜组织中Spdef和Foxa3转录因子的表达量明显下调，其差异有统计学意义。
　　结论:1、表面外胚层Smad4基因的缺失会造成小鼠眼发育异常，结膜杯状细胞发育延迟，数量明显减少。2、Smad4基因的缺失造成小鼠结膜杯状细胞减少可能是眼表细胞凋亡增多引起。3、Smad4基因的缺失使结膜中Spdef和Foxa3转录因子的表达量下调，进而使杯状细胞减少。

目录

声明

摘要

英文缩略语

1 前言

2 材料和方法

2．1 实验动物模型建立和分组

2．2 主要试剂和仪器

2．2．1 主要试剂

2．2．2 主要仪器

2．3 主要实验方法

2．3．1 石蜡切片制备

2．3．2 HE染色

2．3．3 AB染色

2．3．5 Tunel法检测凋亡

2．3．6 Real-time PCR

3．1 动物模型基因型鉴定

3．2 条件敲除Smad4基因导致小鼠眼发育异常

3．3 条件敲除Smad4基因导致小鼠结膜杯状细胞减少

3．4 条件敲除Smad4基因导致小鼠角结膜细胞凋亡增加

3．5 Real-time PCR检测结果

4 讨论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 眼表发育的分子调控机制研究进展

致谢

个人简历