脂联素对结缔组织生长因子介导的瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、迁移和细胞外基质产生的调控机制研究

摘要

目的:瘢痕疙瘩是遗传素质的个体皮肤创伤愈合的过程中，瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloid fibroblasts，KFs)异常增殖，Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白(fibronectin，FN)等细胞外基质(extracellular matrix, ECM)过度沉积导致的纤维过度增生性疾病。瘢痕疙瘩的发病机制尚不明确，现有的研究表明各种细胞因子、生长因子，比如转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、血管内皮细胞生长因子(vascularendothelial growth factor, VEGF)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors，IGF)和血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)等在瘢痕疙瘩发病过程中发挥重要的作用，而细胞因子和生长因子的作用和意义也越来越受到国内外研究者们的重视。
　　结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)是目前研究得较多的一种细胞因子，CTGF属于CCN家族成员，广泛表达于体内多种组织和器官，在瘢痕疙瘩组织中可被诱导而高度表达，并作为TGF-β的下游效应因子或者不依赖于TGF-β而单独作用，从而刺激成纤维细胞的活化、增殖和迁移，并促进ECM的过度累积，是瘢痕疙瘩增殖的必要因素及维持瘢痕疙瘩纤维化的关键生长因子。由于CTGF的生物学效应单一，因此，阻断CTGF的表达或者抑制其活性将可能成为治疗瘢痕疙瘩的有效方法。
　　脂联素是一种由脂肪细胞分泌的新型脂肪因子，广泛表达于人体的各种组织和器官，在外周血中浓度较高。目前已研究证实人体内存在四个脂联素的受体(adiponectin receptors, adipoRs)，即adipoR1、adipoR2、T-钙黏蛋白(T-cadherin)和钙网织蛋白(calreticulin)，脂联素通过与其受体adipoRs结合后，活化腺苷酸活化的蛋白激酶(Adenosine5'-monophosphate activated protein kinase，AMPK)、丝裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidyl-inositol3-kinase，PI3K)/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(serine threonineprotein kinase，Akt)等多种信号通路，在调节高血压、糖尿病、高血脂和动脉粥样硬化等肥胖相关的代谢性疾病过程中发挥重要的作用。此外，脂联素可以作为负性调控因子，发挥调节免疫、抑制细胞增殖、迁移和炎症反应、诱导细胞凋亡的作用。
　　目前关于脂联素在瘢痕疙瘩的相关研究尚未见报导，然而最近研究发现脂联素可抑制多种组织器官及皮肤组织的纤维化进程，由于炎症反应、细胞增殖和迁移增加及凋亡下降是瘢痕疙瘩致病的重要病理基础，而皮肤组织纤维化是瘢痕疙瘩疾病进程的重要特征之一，因此，脂联素可能在瘢痕疙瘩的发病过程中发挥一定的作用。
　　本研究旨在通过研究脂联素对CTGF诱导的KFs增殖、迁移和ECM产生的影响及其作用机制，探讨脂联素在瘢痕疙瘩发病过程中的可能作用。
　　方法:临床收集瘢痕疙瘩患者和正常健康对照者的皮肤组织，采用组织块贴块法原代离体培养KFs和正常皮肤成纤维细胞(normal dermal fibroblasts，NFs)，用波形蛋白vimentin和α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)对培养的成纤维细胞进行鉴定，选取3～5代细胞进行后续的实验。
　　采用逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)、实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，real-time PCR)、蛋白质免疫印迹(western blot)和细胞免疫荧光的方法检测KFs中脂联素及adipoRs的表达，并以NFs作对照。收集的瘢痕疙瘩和正常皮肤组织制备成石蜡切片，观察瘢痕疙瘩和正常皮肤组织形态结构的差别，并以组织免疫组化法检测两种组织中adipoRs的表达及分布。
　　以不同浓度CTGF(0、2 ng/ml、4 ng/ml、6 ng/ml、8 ng/ml和12 ng/ml)和时间点(0 h、2h、6h、12h、24 h、48 h)刺激KFs、NFs，采用细胞计数试剂盒-8(CellCounting Kit-8，CCK-8)检测KFs、NFs的细胞活性，选择CTGF的最佳作用浓度和时间。以外源性CTGF刺激KFs、NFs24 h，采用CCK-8的方法检测细胞增殖、Transwell检测细胞迁移，观察脂联素对CTGF刺激的KFs和NFs细胞增殖和迁移作用的影响;以real-time PCR和western blot的方法检测脂联素对CTGF刺激的KFs和NFs中Ⅰ型胶原、FN及α-SMA的基因和蛋白表达水平的影响。
　　采用RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术，诱导adipoRs基因沉默，并加入外源性CTGF和脂联素刺激KFs24 h，以CCK-8检测细胞增殖，Transwell检测细胞迁移，real-time PCR检测Ⅰ型胶原、FN及α-SMA的基因表达水平。
　　外源性CTGF和脂联素刺激KFs24 h，western blot检测AMPK、MAPK和PI3K-Akt通路的磷酸化水平;在此基础上，加入AMPK、p-38MAPK、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、细胞外信号调节蛋白激酶(Extracellularsignaling regulatory protein kinase，ERK)和Akt的通路阻滞剂，CCK-8检测细胞增殖、Transwell检测细胞迁移，real-time PCR检测Ⅰ型胶原、FN及α-SMA基因的表达水平。
　　结果:瘢痕疙瘩组织表皮厚度显著高于正常皮肤组织，并有较多的炎性细胞浸润和大量的胶原纤维。vimentin和α-SMA免疫染色证实所培养的是成纤维细胞。与正常皮肤组织相比，脂联素及其四个受体adipoR1、adipoR2、T-cadherin和calreticulin从组织水平、细胞水平、蛋白及基因水平在瘢痕疙瘩中的表达均明显下降。
　　外源性CTGF可呈时间和浓度依赖方式促进KFs增殖，在6 ng/ml和24 h时达峰值，这一作用能被脂联素所抑制，在5tg/ml时作用最明显;同样，脂联素能够抑制CTGF诱导的KFs迁移和KFs中Ⅰ型胶原、FN及α-SMA的基因和蛋白水平的表达，而对NFs的作用不明显。
　　脂联素抑制CTGF刺激的KFs中APMK、p-38MAPK和ERK的通路磷酸化，而对JNK和Akt的磷酸化无明显影响;脂联素抑制CTGF诱导的KFs增殖、迁移和ECM的累积作用能被Compound C(APMK通路阻断剂)、SB203580(p-38MAPK通路阻断剂)和PD98059(ERK通路阻断剂)和小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)-adipoR1所下调。
　　结论:脂联素及其受体adipoRs在瘢痕疙瘩组织和细胞中的表达较正常皮肤组织下降;脂联素可以通过adipoR1和APMK、p-38MAPK及ERK信号通路抑制CTGF诱导的KFs增殖、迁移和ECM的累积作用，提示脂联素可能在瘢痕疙瘩的发病过程中发挥一定的作用，可能为瘢痕疙瘩的治疗提供新的思路。

目录

声明

摘要

英文缩略语

前言

1 脂联素及其受体在瘢痕疙瘩中的表达

1．1．1 标本来源

1．1．2 实验设备和材料

1．1．3 实验试剂

1．1．4 主要试剂配制

1．1．5 实验方法

1．1．6 统计学分析

1．2 结果

1．3 小结

2 脂联素抑制CTGF诱导的KFs增殖、迁移和ECM的累积

2．1 实验材料和方法

2．1．1 细胞来源

2．1．2 实验设备和材料

2．1．3 实验试剂

2．1．4 主要试剂配制

2．1．5 实验方法

2．1．6 统计学分析

2．2 结果

2．3 小结

3 诱导脂联素受体的基因沉默

3．1 实验材料和方法

3．1．1 细胞来源

3．1．2 实验设备和材料

3．1．3 实验试剂

3．1．4 实验方法

3．1．5 统计学分析

3．2 结果

3．2 小结

4 脂联素调控CTGF刺激KFs增殖、迁移和ECM产生的主要细胞内信号通路

4．1．2 实验设备和材料

4．1．3 实验试剂

4．1．4 主要试剂配制

4．1．5 实验方法

4．1．6 统计学分析

4．2 结果

4．3 小结

5 讨论

6 结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述一 脂联素与免疫性皮肤病

综述二 结缔组织生长因子在瘢痕疙瘩中的研究进展

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简历