热加工处理转Bt水稻基因的降解及其检测研究

摘要

在我国自主转Bt基因水稻快速发展的背景下，针对目前对其在加工品中的检测还没有系统研究的情况下，本研究利用外源模拟热加工的方法，选取我国目前几个成熟的转Bt基因水稻作为研究对象，研究适合含有米质品加工品的DNA提取方法，并研究转Bt基因水稻不同加工过程内、外源基因及Bt蛋白含量的降解规律，建立相应的检测技术，完善加工品转基因成份的检测规程，为转基因成份的检测和溯源提供技术支持，对于转基因生物安全监管具有重要意义。主要研究结果如下：
　　1.DNA提取方法研究：本实验对比了5种不同方法提取转Bt基因水稻（Bt-ZJ22）及含有米质品的加工品DNA的效果。以确定适合转基因水稻及其加工品DNA的提取方法，为后续建立转基因水稻及其加工品的PCR检测方法莫定基础。结果显示CTAB法和碱处理法所提取的DNA得率较高；在纯度上5种方法相差不大；琼脂糖凝胶电泳检测5种方法提取的DNA完整性显示所有样品提取的DNA均严重降解；在以水稻内标准基因SPS进行PCR扩增时，Wizardkit法扩增效果最好，能够满足PCR定性鉴定的需要，而且提取过程简单、快速。综合考虑，Wizardkit法更适合于转基因水稻及其加工品PCR检测中DNA模板的制备。
　　2.热加工处理对转Bt基因水稻内外源基因的影响：采用高温灭活、水煮、高温烘干和微波4种外源模拟热加工的方法处理3种转Bt基因水稻（KMD1、TT51-1和KF6），按照国家标准对水稻内标准基因SPS、调控元件CaMV35S启动子和NOS终止子、外源基因Bt进行定性PCR检测，研究目前对这三种转基因水稻的检测方法是否适合检测其在加工品中的成份。并针对转Bt基因水稻外源基因各个片断（Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ab/Cry1Ac等）利用引物设计软件PrimerPremier5.0设计相应的引物，对水稻内源SPS基因和外源Bt基因进行不同大小片段的PCR扩增，了解转Bt基因水稻在模拟热加工过程中内、外源基因的降解规律，寻找外源基因在加工品中的稳定区域。研究结果表明，三种Bt基因在热处理过程中的降解情况不尽相同。热加工过程无论对内源基因和外源插入基因的检测都有影响，转基因水稻中的各种外源成分在不同加工条件下稳定性不同。本文新设计的引物可以成功的用于转基因水稻及其加工产品的检测。
　　3.热加工处理对转Bt基因水稻蛋白含量的影响：实验中采用ELISA方法测定了不同热加工处理转Bt基因水稻种子中Bt蛋白的表达水平及蛋白含量，结果显示微波和180℃烘干处理仍能检测出Bt蛋白；高温灭活处理在TT51-1和KF6中能检测到极少量的蛋白含量，KMD1中未检出；200℃烘干和水煮处理对Bt蛋白含量影响较大，在三种水稻中均未检测出Bt蛋白。

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主要符号表

第一章 文献综述

1.1 转基因植物的安全性

1.2 转基因植物的全球地位和潜在贡献

1.3 转基因成分检测技术

1.4 本论文的研究目的、意义和主要研究内容

第二章 转基因水稻及米制品DNA提取方法比较

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论

第三章 转Bt基因水稻内、外源基因在热加工过程中变化规律研究

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

第四章 热加工对转Bt基因水稻中蛋白含量的影响研究

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

结 论

参考文献

个人简历

致谢