中国两性生殖卤虫早期胚胎发育相关基因的研究

摘要

卤虫(Artemia)隶属于甲壳纲(Crustacea)、无甲目(Anostacea)、卤虫属(Artemia)。卤虫广泛分布于内陆盐湖和海岸盐田中，是一个广温广布种。我国对于卤虫的研究起步较晚，从80年代初至今在形态学、发育生物学、生态学、资源生物学、遗传学等学科的卤虫研究已有报道。但关于中国卤虫(Artemia)早期发育过程中基因表达的研究很少，还有待于进一步深入细致的研究和分析。mRNA差异显示法是由Liang和Pardee于1992年建立起来的，是用于显示不同组织和细胞之间mRNA差异的方法。因此，本文利用mRNA差异显示方法对中国山西运城两性生殖卤虫胚胎发育相关基因进行了较深入的研究。以三种单碱基锚定引物对发育0hr，5hr,10hr,15hr,22hr和10d的两性生殖卤虫的RNA进行反转录和26种随机引物进行PCR反应，经非变性的10％聚丙稀酰胺凝胶电泳后，用硝酸银染色得到区分度较好的差异表达图谱，共回收211条DNA片段，然后从中挑取片段长度260～800bp左右的20条条带进行克隆、测序，作为ESTs进行同源序列比较，得到了4个与卤虫早期胚胎发育相关的表达片段，将其命名为ed1-ed4。经序列结果与GeneBank数据库比对后认为，ed1可能是富甘氨酸蛋白的基因片段，它是一盐胁迫应答相关基因，这与卤虫生活的高盐度环境相适应；ed2很可能是某种反转录酶的基因片段；ed3可能通过改变DNA结构或通过与特异性蛋白质结合而发挥基因调控作用；ed4也很可能是过氧化氢酶的基因片段，它可能在卤虫发育过程中清除自由基和保护机体免受损伤方面起着重要作用。

目录

1.前言

1.1与发育相关的基因家族

1.1.1 HOX基因家族

1.1.2 SOX基因家族

1.1.3 DMRT基因家庭

1.2 mRNA差异显示技术的研究进展

1.2.1 mRNA差异显示的基本原理与方法

1.2.2 mRNA差异显示技术的特点

1.2.3 mRNA差异显示技术的改进

1.2.4 mRNA差异显示技术的应用现状

1.3卤虫分子生物学和分类学的研究现状

1.3.1卤虫分子生物学研究进展

1.3.2卤虫分类学研究进展

1.4甲壳动物胚胎学的研究

1.5研究意义

2.材料与方法

2.1实验材料

2.2实验仪器

2.3实验试剂

2.3.1总RNA提取及纯化试剂

2.3.2反转录及PCR相关试剂

2.3.3核酸电泳试剂及硝酸银染料

2.3.4克隆试剂

2.4实验方法

2.4.1卤虫卵孵化及培养条件

2.4.2总RNA的提取

2.4.3 RNA的纯化

2.4.4反转录

2.4.5 PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.4.6硝酸银染色和差异条带的回收纯化

2.4.7再扩增

2.4.8差异片段的克隆

2.4.9差异片段的测序

2.4.10序列分析

3.结果

3.1 RNA检测结果

3.2 PCR扩增结果

3.3差异条带再扩增结果

3.4序列结果及同源性比较分析

3.4.1edl序列及同源性比对结果

3.4.2 ed2序列及同源性比对结果

3.4.3 ed3序列及同源性比对结果

3.4.4 ed4序列及同源性比对结果

4.讨论

4.1两性生殖卤虫胚胎发育相关基因的分析

4.1.1富甘氨酸蛋白在卤虫胚胎发育过程中的重要作用

4.1.2卤虫可能存在某种反转录酶

4.1.3非翻译区的重复序列

4.1.4过氧化氢酶的抗氧化防御功能

4.2降低差异显示PCR假阳性和提高重复性的几种策略

4.2.1高质量的总RNA是降低假阳性率的前提

4.2.2引物的改进提高了DDRT-PCR的重复性

4.2.3选择最适的反转录和PCR退火温度

4.2.4设立重复对照降低假阳性率

5.结论

参考文献

致谢

学位论文独创性声明及学位论文版权使用授权书