中国卤虫革兰氏阴性菌结合蛋白在早期胚胎发育中的表达及抗菌机制的研究

摘要

卤虫(Artemia)俗名为盐水丰年虫、盐水丰年虾、卤虾等,它属于甲壳纲,鳃足亚纲,无甲目,卤虫科,卤虫属。无脊椎动物由于没有类似于T细胞和B细胞的专一的特异性免疫系统,先天免疫系统就是其唯一的防御系统。先天免疫系统的非己识别在无脊椎动物中非常重要。因为一般认为无脊椎动物缺少适应性免疫。近年来,无脊椎动物先天免疫方面的研究进展较快。无脊椎动物的先天免疫系统包括细胞和体液防卫机制,这两种机制可被模式识别受体(PRRs)分子所触发,PPRs可以与微生物表面特异的物质识别并结合,称病菌结合分子模式(pathogen associated molecular patterns),通过结合,这些PPRs可以通过包囊和噬菌作用直接杀死微生物,或者通过丝氨酸蛋白酶级联反应和细胞内免疫信号途径间接引发不同的防御反应,如控制抗菌肽效应基因的表达等。无脊椎动物模式识别受体识别革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌后可引发2条不同的信号通路,Toll途径和Imd途径:革兰氏阳性菌特异引发Toll途径而革兰氏阴性菌特异引发Imd途径。Toll和Imd途径被激活后,通过NF-kB样转录因子调控抗菌肽基因的表达,合成各种抗菌肽抵御和消灭外源入侵微生物。革兰氏阴性菌结合蛋白(GNBPs)是无脊椎动物先天免疫系统中的一类重要模式识别受体,在识别微生物病原并引发一系列级联反应做出免疫应答过程中起重要作用,本文以卤虫为实验材料,成功克隆并得到GNBP基因的全序列。利用整体免疫组化技术和实时定量PCR技术对GNBP在卤虫胚胎发育不同时期及菌刺激实验中的表达部位和表达量进行了研究,结果表明GNBP在胚胎发育各时期呈组成性表达,呈现一种先降后升的趋势,并在10d表达量最高,当用革兰氏阴性菌刺激中国卤虫后,GNBP基因表达随菌液浓度升高而下调。而用革兰氏阳性菌刺激中国卤虫后,GNBP表达量则随菌液浓度升高而上调。随着发育的进行,整体免疫组化结果显示GNBP的表达位置也出现区域化表达现象,即主要集中在头胸和消化道表面表达。

目录

文摘

英文文摘

1.前言

1.1 卤虫的研究概述

1.1.1 卤虫的形态和习性及地理分布

1.1.2 卤虫分类地位及经济价值

1.1.3 卤虫胚胎发育过程及生活史

1.1.4 卤虫胚胎发育相关基因研究

1.1.5 卤虫免疫基因研究进展

1.2 GNBP基因相关研究展

1.2.1 模式识别受体及无脊椎动物先天免疫应答

1.2.2 GNBP的结构和功能研究展

2.材料与方法

2.1 材料

2.1.1 卤虫孵化及培养条件

2.1.2 主要试剂

2.2 方法

2.2.1 卤虫的饲养

2.2.2 整体免疫组织化学

2.2.3 卤虫总RNA的提取

2.2.4 反转录合成cDNA

2.2.5 调取部分目的基因并测序

2.2.6 卤虫菌刺激实验

2.2.7 实验定量PCR

3.结果

3.1 RNA提取质量

3.2 GNBP部分序列

3.3 GNBP全长序列

3.4 GNBP基因信息学分析

3.5 GNBP在卤虫不同发育时期的表达

3.5.1 免疫组化结果

3.5.2 real time PCR分析结果

4.讨论

4.1 中国卤虫GNBP基因的序列及功能分析

4.2 中国卤虫GNBP基因的表达分析

4.3 中国卤虫抗菌机制的研究

4.4 实验条件的优化

4.4.1 卤虫RNA提取及反转录方法的优化

4.4.2 PCR及real time PCR反应的优化

参考文献

致谢