AtMYB2转录因子的原核表达及与S/CMO基因启动子相互作用分析

摘要

AtMYB2转录因子属于MYB家族蛋白，它的表达受ABA、脱水和盐诱导，它能与TGGTTAG(反向互补序列为CTAACCA)序列结合，促进下游基因的表达。胆碱单加氧酶(CMO)是植物体内催化胆碱合成甜菜碱第一步反应过程中的关键酶，它的表达是受盐诱导的。辽宁碱蓬CMO基因启动子-267～+1bp区段(命名为pC5)是盐诱导启动子，其序列上含有AtMYB2转录因子的识别位点TAACCA。在AtMYB2/CMO-pC5双价转基因烟草体内，AtMYB2转录因子能使转基因烟草中GUS活性增加，AtMYB2转录因子在体内能与CMO启动子相互作用。本实验用原核表达的方法，纯化得到AtMYB2融合蛋白，通过EMSA实验，验证在体外AtMYB2转录因子能否与CMO基因启动子直接结合，从而分析AtMYB2转录因子对CMO基因表达的调控作用。主要内容与结果如下：
　　 1、构建了原核表达载体pET30a-AtMYB2，并将其转化到E.BL21(DE3)菌株中，获得工程菌E.BL21-pET30a-AtMYB2。
　　 2、AtMYB2融合蛋白可在大肠杆菌中高效表达，融合蛋白既以可溶蛋白形式存在，也以包涵体形式存在。通过从IPTG浓度、诱导温度、诱导时间三方面因素优化了AtMYB2融合蛋白可溶表达的最佳条件，确定了以0.1mM IPTG诱导，30℃培养10h，可溶蛋白表达量最高。
　　 3、利用Ni2+亲和纯化了AtMYB2可溶蛋白和6xHis载体蛋白。
　　 4、通过凝胶阻滞分析实验验证AtMYB2蛋白与CMO基因启动子之间的相互作用，结果表明，AtMYB2转录因子能与SICMO启动子中TAACCA序列直接结合。进一步证明AtMYB2可能是调控CMO基因表达的一个转录因子