七鳃鳗PHB2增强细胞氧化应激耐受的作用及机制初探

摘要

七鳃鳗是我国东北部特有的鱼形动物，是连接无脊椎与脊椎动物的桥梁。
　　PHB蛋白广泛分布于多种生物细胞中，主要以异源二聚体的形式锚定在线粒体内膜，动态维持线粒体结构及功能的稳定。当线粒体氧化呼吸链功能异常，氧自由基过量积累，极易形成氧化应激，它是引起神经退行性疾病、肿瘤及诸多慢性病症的重要原因。基于PHB动态调节线粒体功能稳定与细胞氧化应激反应紧密相关，PHB正逐步成为研究多种细胞增强氧化应激耐受作用的热点蛋白。然而PHB家族之一的PHB2与处于氧化应激环境中七鳃鳗适应性的关系，目前尚无人研究。本论文以七鳃鳗PHB2蛋白在组织、细胞氧化应激中的作用和机制为着眼点开展研究，有助于七鳃鳗PHB2蛋白功能的揭示，为阐述人PHB2在氧化应激中作用机制的演化提供了线索。
　　本研究利用免疫荧光实验检测了七鳃鳗Lm-PHB2蛋白在鳃和肾细胞中的定位，利用阿霉素注射和H2O2刺激的方法分别构建七鳃鳗氧化应激动物模型和人正常细胞的氧化应激模型，通过QPCR和Western blot的方法检测了Lm-PHB2在氧化应激刺激前后各组织中的分布和表达，通过外加蛋白孵育细胞和构建真核表达载体及细胞瞬时转染实验，利用MTT法分析了重组蛋白rLm-PHB2和真核表达蛋白Lm-PHB2在人张氏肝细胞和肺上皮细胞氧化应激中的作用，利用激光共聚焦显微镜观察了氧化应激条件下Lm-PHB2在人张氏肝细胞中的定位迁移，利用QPCR法分析了氧化应激条件下Lm-PHB2与VDAC3和TP53之间的表达关系。结果表明，Lm-PHB2主要定位在线粒体和细胞核;Lm-PHB2在七鳃鳗的主要组织中均有表达，且它的表达与组织细胞的氧化应激密切相关;rLm-PHB2能够增加人张氏肝细胞和肺上皮细胞的氧化应激耐受性;Lm-PHB2增强张氏肝细胞氧化应激耐受性与其从细胞核向线粒体的定位迁移紧密相关;氧化应激条件下Lm-PHB2与VDAC3和TP53在不同组织中表现出不同的表达关系。综上，七鳃鳗Lm-PHB2能够增强细胞的氧化应激耐受性，在人张氏肝细胞中很可能是通过蛋白的定位迁移实现的，而在七鳃鳗的组织细胞中可能是利用与VDAC3和TP53的相互作用，通过多条信号通路增强细胞的氧化应激耐受性。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 七鳃鳗研究进展及其特殊地位

1．1．1 东北七鳃鳗概况

1．1．2 七鳃鳗研究进展

1．1．3 七鳃鳗的研究价值

1．2 PHB研究进展

1．2．1 PHB的结构

1．2．2 PHB的定位

1．2．3 PHB的功能

1．3 氧化应激

1．3．1 活性氧及氧化应激

1．3．2 活性氧的生理功能

1．3．3 活性氧对机体的损伤

1．3．4 氧化应激的研究意义

1．4 本论文的研究目的和意义

第2章 phb2在七鳃鳗各组织中的表达

2．1 实验材料与方法

2．1．1 实验材料、试剂与设备

2．1．2 实验方法

2．2 结果

2．2．1 七鳃鳗Lm-PHB2蛋白的亚细胞定位

2．2．2 RNA提取结果

2．2．3 氧化应激模型构建

2．2．4 phb2在七鳃鳗各组织中mRNA的相对表达量

2．2．5 PHB2在七鳃鳗各组织中的蛋白表达量

2．3 讨论

2．4 小结

第3章 rpEGFP-N1-Lm-phb2真核表达载体的构建

3．1 实验材料与方法

3．1．1 实验材料、试剂与设备

3．1．2 实验方法

3．2 实验结果

3．2．1 七鳃鳗phb2基因扩增

3．2．2 七鳃鳗phb2真核表达重组质粒的构建

3．2．3 重组质粒rpEGFP-N1-Lm-phb2的真核转染验证

3．3 讨论

3．4 小结

第4章 Lm-PHB2增强CHL和L132细胞的氧化应激耐受性

4．1 实验材料与方法

4．1．1 实验材料、试剂与设备

4．1．2 实验方法

4．2 实验结果

4．2．1 重组蛋白的诱导表达与纯化

4．2．2 重组蛋白rLm-PHB2增强CHL和L132细胞氧化应激耐受性

4．2．3 真核表达Lm-PHB2增强CHL细胞氧化应激耐受性

4．3 讨论

4．4 小结

第5章 七鳃鳗PHB2增强细胞氧化应激耐受作用的机制初探

5．1 实验材料与方法

5．1．1 实验材料、试剂与设备

5．1．2 实验方法

5．2 实验结果

5．2．1 RNA提取结果

5．2．2 氧化应激状态下Lm-PHB2蛋白的定位及迁移

5．2．3 phb2、tp53、vdac3在免疫后七鳃鳗各组织的分布变化

5．3 讨论

5．4 小结

结论

本文创新点

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢