七鳃鳗血清中杀菌蛋白质LIP的分离及其作用机制研究

摘要

免疫防御的起源与演化问题一直是免疫学研究热点之一，作为最低等脊椎动物代表七鳃鳗，一直以来备受关注。因此，基于七鳃鳗免疫防御研究为我们更好的从进化角度来探讨免疫防御的更替过程具有重要意义。本论文利用凝胶层析和液质联用质谱技术从七鳃鳗血清中分离、纯化并鉴定出发挥杀菌功能的LIP(Lamprey immunity protein)，并且对LIP杀菌机理进行研究。
　　研究表明七鳃鳗血清具有较强杀菌活性;运用凝胶过滤色谱与杀菌活性相结合的检测方法，逐步缩小血清中具有杀菌活性蛋白质范围;利用液质联用质谱技术对杀菌活性蛋白质进行鉴定为最终解析七鳃鳗血清中杀菌活性蛋白质的氨基酸组成奠定基础。
　　根据质谱鉴定结果，首先利用生物信息学方法对ENSPMAP00000004567、ENSPMAP00000005857、ENSPMAP00000001744、ENSPMAP00000005891的理化性质、二级结构、三级结构、序列比对和系统发育做系统分析;其次，利用基因工程手段对Myoglobin5857、Myoglobin1744和4567进行克隆表达及蛋白质纯化;第三，对LIP进行大量表达并纯化;第四，利用纯化后的四种蛋白质并结合抑菌实验检测方法，对这几种蛋白质的杀菌活性进行检测，最终确定LIP为七鳃鳗体内发挥杀菌功能蛋白质之一，Myoglobin5857、Myoglobin1744和4567作为一种“伴侣蛋白质”潜在的参与LIP介导的杀菌过程。第五，利用抗体清除与加回实验进一步证明了LIP为七鳃鳗体内发挥杀菌功能蛋白质。
　　LIP杀菌机制进行研究，结果表明首先LIP具有较强的杀菌活性;其次，LIP以多聚体的形式沉积于细菌表面并能够与细菌细胞膜表面的磷脂酰甘油、胆固醇和甘油磷脂和脂多糖结合，同时不能够直接与磷脂酰胆碱和肽聚糖结合;第三，与细菌结合后的LIP能够在短时间内诱使细菌细胞内活性氧水平明显升高;第四，LIP诱使细菌细胞膜发生去极化现象，进而对细菌细胞质膜产生破坏作用;第五，LIP最终导致细菌进入以质壁分离和内容物外泄为特征的细菌细胞坏死状态。
　　LIP的发现及杀菌机制的解析，为进一步研究七鳃鳗机体免疫调节及抵御外源病原体入侵的作用机理具有重要意义。同时，LIP的发现为能够更好地从源头上阐述天然免疫与适应性免疫相互作用与进化关系，奠定了坚实的理论基础。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 七鳃鳗生活史

1．2 造血

1．2．1 肠沟

1．2．2 肾褶皱

1．2．3 神经轴上髓样小体

1．2．4 其它潜在造血器官

1．2．5 造血组织的退化

1．2．6 七鳃鳗的免疫防御

1．3 适应性免疫反应

1．3．1 可变淋巴细胞受体的发现

1．3．2 VLR对抗原识别的结构基础

1．3．3 T-like和B-like淋巴细胞群

1．4 小结

第二章 七鳃鳗血清杀菌蛋白质的分离

2．1 材料及方法

2．1．1 七鳃鳗及细菌菌株

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器

2．1．4 七鳃鳗血清的制备

2．1．5 七鳃鳗血清杀菌蛋白质鉴定方法

2．1．6 Superdex 200凝胶过滤层析

2．1．7 Superdex 75凝胶过滤层析

2．1．8 溶液酶解

2．2 结果

2．2．1 七鳃鳗血清对细菌杀伤活性检测

2．2．2 血清杀菌流份分离

2．2．3 杀菌活性流份的质谱鉴定

2．3 讨论

2．4 小结

第三章 七鳃鳗血清杀菌蛋白质的鉴定

3．1 材料及方法

3．1．1 七鳃鳗及细菌菌株

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要仪器

3．1．4 一级结构分析

3．1．5 蛋白质二级结构模拟

3．1．6 级结构模拟

3．1．7 同源序列比对

3．1．8 系统发育分析

3．1．9 引物设计

3．1．10 七鳃鳗神经轴上髓样小体总RNA的提取

3．1．11 反转录反应

3．1．12 PCR反应

3．1．13 目的片段回收

3．1．14 质粒提取

3．1．15 目的片段与载体连接

3．1．16 转化

3．1．17 菌落PCR

3．1．18 诱导表达重组质粒

3．1．19 重组蛋白纯化

3．1．20 溶液酶解

3．1．21 血清中LIP的清除

3．2 结果

3．2．1 ENSPMAP00000004567的理化性质

3．2．2 ENSPMAP00000004567同源序列比对与进化分析

3．2．3 ENSPMAP00000005857的理化性质

3．2．4 ENSPMAP00000005891的理化性质

3．2．5 ENSPMAP00000001744的理化性质

3．2．6 ENSPMAP00000005857、ENSPMAP00000005891、ENSPMAP00000001744同源序列比对与进化分析

3．2．7 七鳃鳗神经轴上髓样小体cDNA模板制备

3．2．8 pET32a-Myoglobin 5857、pET32a-Myoglobin 1744和pET32a-4567重组载体的构建

3．2．9 蛋白质纯化及杀菌活性鉴定

3．2．10 七鳃鳗血清中LIP杀菌活性检测

3．3 小结

第四章 LIP杀菌活性检测及杀菌机制研究

4．1 材料及方法

4．1．1 主要试剂

4．1．2 主要仪器

4．1．3 LIP杀菌动力学检测

4．1．4 扫描电子显微镜观察LIP对细菌的杀菌作用

4．1．5 透射电子显微镜观察LIP对细菌的杀菌作用

4．1．6 荧光标记LIP

4．1．7 超高分辨成像系统对LIP定位于细菌细胞表面进行检测

4．1．8 LIP与细园孵育后细函质膜提取

4．1．9 ITC检测LIP与LPS、PG、CL、PE和PGN的相互作用

4．1．10 Dot blotting检测LIP与LPS、PG、CL、PE和PGN的相互作用

4．1．11 LIP与细菌孵育后细菌活性氧水平的检测

4．1．12 DiSC3-5检测细菌细胞膜去极化

4．1．13 LIP对人工模拟细菌细胞质膜破坏的检测

4．2 结果

4．2．1 LIP杀面动力学研究

4．2．2 电子镜观票LIP对细菌杀伤

4．2．3 超高分辨成像系统对LIP定位于细菌细胞质膜进行检测

4．2．4 细菌细胞膜表面LIP作用方式鉴定

4．2．5 LIP与PG、CL、PE、LPS和PEG的相互作用检测

4．2．6 LIP对细菌细胞膜去极化作用及对人工模拟质膜的破坏

4．2．7 LIP对细菌活性氧水平的影响

4．3 讨论

4．4 小结

第五章 结论

本论文的创新点

参考文献

附录

攻读博士学位期间发表学术论文情况

攻读博士学位期间申请科研专利

攻读博士学位期间获奖情况

攻读博士学位期间参与项目情况

致谢