条斑紫菜PyCaM基因与PyHSP70基因的克隆、原核表达及功能分析

摘要

条斑紫菜（P.yezoensis）是我国重要的经济类海藻之一，隶属于红藻纲，红毛菜科。主要分布在日本、韩国和中国。
　　本研究首先以条斑紫菜CaM基因和HSP70基因为关键词，在GeneBank的dbEST数据库中搜索相关的EST片段，使用DNAMAN软件对搜索得到的EST片段进行拼接，分别得到两条contig。利用NCBI网站的BlastX功能进行序列分析，分析结果指向其他物种CaM基因和HSP70基因。通过序列比对，contig引物设计，PCR产物回收，获得这两条基因，并通过测序进行验证，命名为PyCaM，PyHSP70。生物信息学分析显示，PyCaM ORF序列共453bp，编码150个氨基酸，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA，编码蛋白质的分子量约为16700Da，等电点为4.12，信号肽预测结果显示PyCaM无信号肽序列。对PyCaM核苷酸序列进行BLASTx分析，结果显示，与其他藻类CaM核苷酸序列相似性较高，达到90％以上，并预测到EF手型区域以及钙离子结合位点;PyHSP70ORF序列共2007bp，编码668个氨基酸，起始密码子为ATG，终止密码子为TAG，编码蛋白质的分子量约为72000Da，等电点为5.17，信号肽预测结果显示PyHSP70无信号肽序列。将PyCaM、PyHSP70 ORF序列分别与pET-28a载体重组，构建两个重组表达载体，并转入大肠杆菌BL21感受态细胞，获得转基因菌株，经IPTG诱导融合蛋白表达，利用SDS-PAGE电泳检测证实PyCaM分子量约为16700Da，PyHSP70分子量约为71000Da，与预测值相符合。将大量诱导的蛋白进行纯化和质谱检测，证明此二蛋白即为条斑紫菜PyCaM、PyHSP70融合蛋白。
　　从实时荧光定量PCR的结果可以看出，条斑紫菜PyHSP70、PyCaM基因响应高温诱导并显著高于对照组，分别在热胁迫1小时、3小时时转录水平达到最高。通过测定条斑紫菜PyHSP70融合蛋白的ATPase活性，证明PyHSP70具有ATPase活性。在测定大肠杆菌转条斑紫菜PyHSP70基因在高温胁迫下生长情况的实验中，转基因大肠杆菌的生长情况明显好于对照组，证明条斑紫菜PyHSP70融合蛋白的过量表达可以提高大肠杆菌的耐热性。本研究第一次利用凝胶覆盖技术证明条斑紫菜融合蛋白PyCaM与PyHSP70在体外具有结合效应，这些结论对进一步研究植物热激信号转导通路奠定理论基础。

目录

声明

摘要

引言

1 文献综述

1．1 条斑紫菜研究概况

1．1．1 条斑紫菜及其食用、经济价值

1．1．2 条斑紫菜的生殖方式及其生活周期

1．1．3 条斑紫菜的研究意义

1．2 植物CaM基因的研究概况

1．2．1 CaM的结构及分布

1．2．2 CaM的作用原理

1．3 植物HSP70基因的研究概况

1．4 Ca2+／CaM与HSP70参与热激信号转导通路

1．5 本实验研究目的及意义

1．6 本研究的主要技术路线

2 条斑紫菜PyCaM基因的克隆及其功能分析

2．1 条斑紫菜PyCaM基因的克隆

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验方法

2．2 条斑紫菜PyCaM基因的生物信息学分析预测

2．3 条斑紫菜PyCaM基因在热胁迫条件下的实时定量表达实验

2．3．1 实验材料

2．3．2 实验方法

2．4 条斑紫菜PyCaM基因的原核表达

2．4．1 实验材料

2．4．2 实验方法

2．5 条斑紫菜PyCaM融合蛋白纯化及浓度测定

2．5．1 实验试剂

2．5．2 实验方法

2．6 结果与分析

2．6．1 条斑紫菜总RNA提取

2．6．2 PCR扩增产物检测与胶回收产物检测

2．6．3 条斑紫菜PyCaM基因的生物信息学预测结果分析

2．6．4 条斑紫菜PyCaM基因在热胁迫条件下的实时定量表达实验结果分析

2．6．5 条斑紫菜PyCaM融合蛋白诱导表达条件的优化结果分析

2．6．6 条斑紫菜PyCaM融合蛋白表达形式检测结果分析

2．6．7 条斑紫菜PyCaM融合蛋白浓度测定结果

2．7 讨论

3 条斑紫菜PyHSP70基因的克隆及其功能分析

3．1 条斑紫菜PyHSP70基因的克隆

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验方法

3．2 条斑紫菜PyHSP70基因的生物信息学分析预测

3．3 条斑紫菜PyHSP70基因在热胁迫条件下的实时定量表达实验

3．3．1 实验材料

3．3．2 实验方法

3．4 条斑紫菜PyHSP70基因的原核表达

3．4．1 实验材料

3．4．2 实验方法

3．5 条斑紫菜PyHSP70融合蛋白纯化及浓度测定

3．6 大肠杆菌转PyHSP70基因在高温胁迫下的生长情况测定

3．6．1 实验材料、仪器设备及药品

3．6．2 实验方法

3．7 条斑紫菜HSP70融合蛋白ATPase活性测定

3．7．1 实验材料、仪器设备及药品

3．7．2 实验方法

3．8 结果与分析

3．8．1 条斑紫菜总RNA提取

3．8．2 PCR扩增产物检测与胶回收产物检测

3．8．3 条斑紫菜PyHSP7O基因的生物信息学预测结果分析

3．8．4 条斑紫菜PyHSP7O基因在热胁迫条件下的实时定量表达实验结果分析

3．8．5 条斑紫菜PyHSP70融合蛋白诱导表达条件的优化结果分析

3．8．6 条斑紫菜PyHSP70融合蛋白表达形式检测结果分析

3．8．7 条斑紫菜PyHSP70融合蛋白浓度测定结果

3．8．8 37℃和45℃条件下转pET-28a-PyHSP70大肠杆菌和转pET-28a大肠杆菌的生长曲线测定结果

3．8．9 47．5℃条件下转pET-28a-PyHSP70大肠杆菌和转pET-28a大肠杆菌的菌体存活率测定结果

3．8．10 不同时间条斑紫菜PyHSP70融合蛋白对应的ATP水解百分比测定结果

3．9 讨论

4 条斑紫菜融合蛋白PyCaM与PyHSP70体外互作实验

4．1 实验材料

4．1．1 实验试剂

4．1．2 实验仪器

4．2 实验方法

4．3 结果与分析

4．4 讨论

结论

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢