新型可更新表面电化学免疫传感器检测雌二醇的研究

摘要

本研究以β-雌二醇为目标物，通过对抗体进行疏水化处理，构建了一种可更新表面的电化学免疫传感器，实现了电化学传感器工作电极表面敏感膜的快速更新，克服了以往免疫传感器抗体固定化过程繁琐、敏感膜重现性差、再生困难等方面的不足，为电化学传感器敏感膜的构建及在线检测提供了一种新方法。主要研究内容包括:
　　采用混合酸酐法将雌二醇半抗原与卵清白蛋白(OVA)偶联，用BCA试剂盒蛋白定量、紫外光谱、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定偶联结果。紫外扫描结果表明通过混合酸酐法制备的半抗原与OVA偶联物的摩尔吸收系数约为93238，显著大于半抗原和载体蛋白。SDS-PAGE实验结果显示偶联物纯度较高。通过间接竞争ELISA绘制标准曲线，得到β-雌二醇的检出限为0.52μg/L，证实单克隆抗体与类似物己烯雌酚和孕酮的交叉反应率小于0.01％，具有较高的特异性和亲和力。用β-雌二醇对自来水进行加标回收并用间接竞争ELISA测定回收率在78％和134％之间。
　　采用活性酯法活化抗体上的羧基，以氨基壬烷作为疏水化试剂对抗雌二醇单克隆抗体进行了疏水化处理，实验考察了反应时间、反应介质、卵磷脂浓度等因素对反应结果的影响，凝胶电泳及电化学两种方法鉴定了抗体的疏水化效果及活性。结果表明:在室温条件下，疏水化反应3小时，卵磷脂浓度为1mg/mL时抗体与抗原响应较好。
　　实验采用三电极检测系统，以Ag/AgCl电极为参比电极，Pt电极为对电极，修饰抗体成膜液的玻璃电极为工作电极，KCl作为电解液，利用顺序注射系统实现液态敏感膜直接更新，初步构建了β-雌二醇检测的可更新表面电化学脂膜免疫传感器。在此基础上，采用线性扫描伏安法考察了该工作电极在不同修饰阶段的电化学性能，并优化了传感器中抗体的固定条件。结果表明该方法对抗原溶液具有很好的响应信号，其可检测范围是0.3～4.2μg/mL，具有操作简单、响应时间短、选择性好等优点，进一步优化后可应用于水样中β-雌二醇的检测。

目录

声明

摘要

部分英文缩略词

第1章 绪论

1．1 β-雌二醇的性质及其危害

1．2 β-雌二醇检测方法

1．2．1 化学检测法

1．2．2 免疫检测法

1．2．3 其它检测法

1．3 电化学脂膜免疫传感器的研究进展

1．3．1 电化学脂膜免疫传感器的发展历史

1．3．2 可更新表面电化学脂膜免疫传感器的作用原理

1．3．3 电化学脂膜免疫传感器的特点及发展方向

1．3．4 电化学脂膜免疫传感器的应用

1．4 本论文研究的思路及意义

第2章 水样中雌二醇酶联免疫检测方法的建立

2．1 实验部分

2．1．1 主要仪器

2．1．2 主要试剂

2．1．3 实验方法

2．2 结果与讨论

2．2．1 合成的雌二醇包被原鉴定结果分析

2．2．2 方阵滴定实验

2．2．3 竞争ELISA的标准曲线

2．2．4 ELISA的交叉反应

2．2．5 样品加标回收

2．3 小结

第3章 雌二醇电化学脂膜免疫传感器的初步研制

3．1 实验部分

3．1．1 主要仪器

3．1．2 主要试剂

3．1．3 实验方法

3．2 结果与讨论

3．2．1 疏水化方法和试剂的选择

3．2．2 疏水化条件的选择

3．2．3 电化学测试条件的选择

3．2．4 脂膜的铂电极的电化学行为

3．2．5 雌二醇脂膜免疫传感器的稳定过程

3．2．6 雌二醇脂膜免疫传感器的初步响应

3．3 小结

第4章 结论

参考文献

致谢