微生物细胞表面的化学/基因改性调控用于重金属分离及（形态）分析

摘要

生物富集应用于重金属污染物的去除及其定量分析（形态分析）具有广阔的应用前景。微生物等生物细胞作为重金属吸附/固相萃取材料具有来源广、成本低、结合位点丰富、吸附容量大等优势，然而低选择性却成为阻碍其发展的最大瓶颈。细胞表面丰富的结合位点使其具有巨大的吸附容量，但却无法保证对目标金属组分的选择性吸附。因此，如何改善细胞对目标离子的选择性，基于细胞自身优势对目标离子进行分析识别，是实现突破的关键。通过化学反应或基因手段对细胞表面进行改性，结合目标金属性质，人为地控制和改变细胞表面官能团的组成，可以有效地提高细胞对目标金属的富集容量和选择性。目前，基于化学/基因改性的微生物细胞在重金属去除中的应用尚处于起步阶段，在重金属定量分析中尚未得到有效的开发和利用，具有广阔的发展潜力。
　　本论文旨在利用化学改性及基因工程手段提高微生物细胞对重金属离子的选择性，探讨内在及外在因素对生物富集过程的影响，了解生物富集机理;探索其在重金属去除领域的应用潜力;建立痕量重金属选择性分离富集及形态分析新方法。
　　论文的第一章介绍了生物富集的性质、分类、机理及其在重金属污染治理及痕量重金属分离富集与形态分析领域的研究现状。
　　论文的第二章用一种简单的修饰方法将枯草芽孢杆菌表面修饰上Fe(Ⅲ)，并对载铁枯草芽孢杆菌对As(Ⅲ)和As(Ⅴ)的吸附行为进行了研究。枯草芽孢表面的铁以无定型水合氧化铁(HFO)的形式存在，细菌载铁量为0.5％(w/w)，细菌存活率为30％。载铁枯草芽孢杆菌对砷的吸附是一个快速的过程，且吸附符合朗格缪尔吸附等温方程。当pH为10时，载铁枯草芽孢杆菌对As(Ⅲ)及As(Ⅴ)均可吸附，且与未修饰细菌相比，As(Ⅴ)的吸附容量提高了11倍。当pH为8时，载铁枯草芽孢杆菌表面每摩尔铁结合As(Ⅲ)/As(Ⅴ)的量远高于文献报道的其他铁基吸附材料。枯草芽孢杆菌表面修饰的HFO不仅提高了细菌对砷的吸附容量，也提高了细菌对不同砷形态的选择性:当pH为3时，载铁枯草芽孢杆菌对As(Ⅲ)几乎不吸附，而对As(Ⅴ)则可定量吸附，为无机砷形态分析提供了基础。
　　论文的第三章基于酸性条件下载铁枯草芽孢杆菌对As(Ⅴ)的选择性吸附，建立了痕量As(Ⅴ)分离富集及无机砷形态分析方法。在pH为3时，载铁枯草芽孢杆菌对As(Ⅴ)吸附效率高达96％，而对As(Ⅲ)几乎没有吸附。采用硝酸作为洗脱剂，可以将吸附的As(Ⅴ)定量洗脱。As(Ⅴ)的含量可利用石墨炉原子吸收测定，As(Ⅲ)可通过预氧化测定总砷含量之后差减求得。在样品体积1000μL的条件下，用100μL HNO3(0.8 mol L-1)为洗脱剂，所建立方法的线性区间为0.30～2.00μgL-1，检出限为0.08μg L-1(3σ，n=7)，精密度为4.0％(1.0μg L-1，n=9)。该方法可用于实际水样中无机砷形态分析。同时，对As(Ⅴ)和载铁枯草芽孢杆菌的结合机理进行了探讨，证实酸性条件下，细菌表面的Fe-OH基团被-OAsO(OH)2取代，As(Ⅴ)以As-Fe-O键结合于细菌表面。
　　论文的第四章采用基因重组技术，将枯草芽孢杆菌的抗砷基因转化入大肠杆菌体内，实现了砷调节蛋白ArsR的胞内表达。利用该工程菌对甲基砷(MMA和DMA)进行生物富集，其富集容量比未表达砷调节蛋白ArsR的菌株分别提高了5.6和3.4倍。工程菌对甲基砷的富集是一个快速的过程，符合朗格缪尔等温方程。实验结果还显示ArsR的胞内表达使得工程菌对甲基砷的富集对pH变化不敏感;离子强度及竞争吸附实验证实工程菌对MMA及DMA的选择性增强。工程菌可以有效地去除低浓度的MMA及DMA，显示了其在水污染治理中的应用潜力。
　　论文的第五章利用表面展示技术，将镉结合短肽CP2表达于酿酒酵母细胞表面，解决了蛋白质胞内表达无法回收金属离子的缺陷。将表面展示的工程酵母菌固定化于微载体Cytopore上后，引入顺序注射-阀上实验室分析系统，建立了痕量镉在线选择性分离富集的新方法。痕量镉离子被固定化工程酵母菌吸附后，采用合适浓度的硝酸即可洗脱，其浓度采用石墨炉原子吸收检测。为了保证分析的重现性，采用可更新分析模式。实验结果表明，多肽的表面展示使得酵母细胞对离子强度及干扰离子的耐受能力分别提高了600倍及25-1000倍。在最佳实验条件下，该系统的富集因子为30倍，检测限为1.1 ng L-1(3σ，n=9)，精密度为3.3％(50 ng L-1，n=11)，线性范围为5-100 ng L-1，采样频率为20 h-1。应用本方法对标准物质及环境水样中的痕量镉进行定量分析，结果令人满意。

目录

声明

摘要

缩写表

第一章 前言

1．1 生物富集材料分类

1．1．1 微生物

1．1．2 藻类

1．1．3 天然生物材料

1．2 生物富集原理

1．2．1 生物吸附

1．2．2 生物积累

1．3 影响生物富集的因素

1．3．1 内在因素

1．3．2 外界因素

1．4 生物富集材料的处理方法

1．4．1 化学改性

1．4．2 基因改性

1．4．3 固定化

1．5 生物富集在重金属去除和分析领域中的应用

1．5．1 重金属污染治理

1．5．2 痕量重金属分离富集与形态分析

1．6 本论文的选题思路和研究目标

第二章 载铁枯草芽孢杆菌(Fe-Bac)去除无机砷

2．1 材料与方法

2．1．1 仪器

2．1．2 材料及试剂

2．1．3 枯草芽孢杆菌的培养与细胞表面的修饰

2．1．4 无定形水合氧化铁(Hydrous ferric oxide)的制备

2．1．5 Fe-Bac对砷的吸附

2．2 结果与讨论

2．2．1 枯草芽孢杆菌对As(Ⅲ)／As(Ⅴ)的吸附效率

2．2．2 Fe-Bac的表征

2．2．3 Fe-Bac对As(Ⅲ)／As(Ⅴ)的吸附效率

2．2．4 Fe-Bac对As(Ⅲ)／As(Ⅴ)的吸附行为评价

2．3 本章小结

第三章 Fe-Bac选择性分离富集As(Ⅴ)及无机砷形态分析

3．1 实验部分

3．1．1 仪器

3．1．2 试剂及材料

3．1．3 Fe-Bac分离富集无机砷

3．1．4 样品预处理

3．2 结果与讨论

3．2．1 Fe-Bac对As(Ⅲ)／As(Ⅴ)形态分离

3．2．2 酸性条件下Fe-Bac对As(Ⅴ)吸附的机理

3．2．3 Fe-Bac选择性分离富集As(Ⅴ)及无机砷形态分析

3．2．4 共存离子对As(Ⅴ)分离富集的影响

3．2．5 方法分析性能

3．2．6 样品测定

3．3 本章小结

第四章 砷调节蛋白ArsR的表达及其在有机砷去除中的应用

4．1 实验部分

4．1．1 基因工程理论技术基础

4．1．2 仪器

4．1．3 材料及试剂

4．1．4 重组质粒的构建

4．1．5 ArsR蛋白的表达及分析

4．1．6 有机砷的生物富集

4．2 结果与讨论

4．2．1 ArsR蛋白的表达及分析

4．2．2 耐砷能力的提高

4．2．3 E．coli(ArsR)菌对甲基砷的生物富集

4．2．4 pH值对甲基砷的生物富集的影响

4．2．5 甲基砷生物富集的选择性

4．2．6 细菌用量对甲基砷生物富集的影响

4．3 本章小结

第五章 表面展示短肽酵母高选择性分离富集痕量镉

5．1 实验部分

5．1．1 仪器

5．1．2 材料及试剂

5．1．3 表面展示菌的转化与筛选

5．1．4 表面展示菌Yeast-CP2的培养与固定化

5．1．5 实验流程

5．1．6 样品预处理

5．2 结果与讨论

5．2．1 表面展示短肽提高镉吸附容量

5．2．2 Yeast-CP2的固定化

5．2．3 pH值对镉生物吸附的影响

5．2．4 实验参数优化

5．2．5 选择性

5．2．6 分析性能及样品分析

5．3 本章小结

参考文献

致谢

博士在读期间发表的论文