几种非人灵长类动物末端肠道细菌多样性及潜在价值初探

摘要

哺乳动物肠道聚集着大量的肠道微生物，包括真细菌、真菌、古细菌和病毒，其中，细菌是肠道微生物的最重要组成部分，约占99％的比例，这些微生物和宿主的健康疾病息息相关。研究宿主肠道细菌的组成及变化，对于进一步探索肠道细菌和宿主的健康疾病起着重要作用。以往研究发现哺乳动物的肠道细菌和宿主进化亲缘关系密切相关，而非人灵长类动物有着和人类最近的进化亲缘关系，研究非人灵长类动物肠道细菌组成将是研究人类肠道细菌的重要参考。非人灵长类动物猕猴是很多药物实验的模式动物，而目前缺乏比较系统的关于其肠道细菌的研究。本研究首先重点选择不同年龄、不同健康状况、不同生长环境和喂养条件等猕猴新鲜粪便样品，并采集其他部分灵长目，食肉目和奇蹄目动物的粪便样品作为对照，采用免培养和纯培养相结合的技术，系统揭示这些灵长类动物末端肠道细菌的多样性，同时探索灵长类动物与其他动物和不同条件猕猴末端肠道菌群差异。然后，总体对分离到的部分去重复菌株进行不同生物酶活性检测，获得具备各类生物活性的微生物资源。最后，对部分菌株进行进一步潜在价值探索，包括对其中代表链霉菌株进行基因组测序，并分析其次生代谢产物合成基因簇相关信息，以期为先导化合物药物的开发提供潜力菌株;对棒状杆菌进行产谷氨酸潜力检测，以期为工业生产谷氨酸提供潜力菌株。 本研究总共采集了猕猴粪便样品19份，熊猴、白眉长臂猿粪便样品各2份，滇金丝猴、川金丝猴、黑猩猩、食蟹猴、白颊长臂猿、环尾狐猴、黑叶猴、灰叶猴、东北虎、大熊猫、黑熊、小熊猫、狮子、犀牛、斑马粪便样品各1份。首先，为了初步探索灵长类动物和其他一些动物末端肠道菌异同，通过高通量测序检测了几种灵长目、食肉目、奇蹄目的末端肠道细菌。结果发现，这些动物末端肠道菌群都很丰富，但食肉目动物末端肠道菌群表现出的多样性普遍较低;灵长目与其他动物末端肠道菌群差异显著且每种动物肠道菌群不同;不同动物负责帮助同类食物消化的菌群可能不同;同类食物对不同动物肠道菌群的影响也可能不同。为了进一步研究灵长类动物末端肠道菌群的变化性，即探索不同影响因素对肠道菌群的影响，本次研究对不同条件下的灵长类代表动物猕猴末端肠道细菌进行了高通量检测。结果发现，半野生环境下的猕猴较圈养猕猴肠道菌群更“健康”;母乳和牛奶喂养猕猴肠道菌群不同，但各自应该都有相应的有益菌群;0-3月猕猴的肠道菌群不稳定，表现出比6月-2岁猕猴更高的多样性;6月-2岁猕猴到14岁猕猴的末端肠道菌群多样性随着年龄的增长而增加，但是菌群组成有所改变;腹泻猕猴表现出明显的肠道菌群失调，而瘫痪的猕猴则表现出轻微的肠道菌群失调，但多样性明显降低;另外，在灵长类动物相近种之间其肠道菌群应该比较类似。 纯培养是进一步探索肠道微生物功能及潜在应用价值的基础，为了更多的获得肠道菌群资源，本研究对以猕猴为主结合其他一些灵长类动物和参考的食肉目及奇蹄目动物粪便样品进行了细菌和放线菌分离鉴定。总共分离鉴定得到了892株菌，分布在81个属，且其中57个属同时在免培养测序中检测到，占所分离属的70％。很多样品通过直接划线培养能体现出来的区别在分离纯化后的菌株分析中反而不能很好体现。另外结合免培养分析，分离到了一些可能为宿主有益菌群的菌株，如Pseudomonas caeni和Psychrobacter faecalis。通过形态、生理生化、化学和分子各个方面对从两种灵长类动物粪便分离到的2株潜在新种进行了鉴定，确定YIM101505T属于Corynebacterium的一个新种，命名为Corynebacterium faecale;YIM101593T属于Mobilicoccus的一个新种，命名为Mobilicoccus caccae。 为了进一步探索灵长类肠道微生物功能及潜在应用价值，本次研究首先通过部分去重复且从灵长类动物粪便分离到的约460株菌进行淀粉酶、脂酶、纤维素酶、酪蛋白酶、β-半乳糖酶活性检测，然后对通过抗菌活性和聚类分析筛选出来的5株筛选出来的链霉菌进行了基因组测序和基因簇分析并通过对其中一株菌进行次级代谢产物分离去验证基因簇预测的准确性，最后对分析可能产谷氨酸的棒状杆菌进行了产谷氨酸潜力检测。结果发现，所分离到的约三分之二的菌株c呈现一种或者一种以上的酶活性，且不同类的菌株呈现不同的酶活侧重;5株链霉菌都具有丰富的次级代谢产物基因簇，其中以菌株101272和100880最多，分别检测到47个和42个;菌株100880分离到的主要次级代谢产物所对应的基因簇并没有被预测到，不过通过该基因簇的核心基因和全基因组进行比对，发现这些核心基因分布在不同的scaffold上，造成以上的可能原因是菌株100880的基因组拼接错误率较高。灵长类动物肠道的棒状杆菌类群比较丰富，且绝大多数应是兼性厌氧、无毒害作用，部分具有产谷氨酸的潜力。 综上所述，非人灵长类动物末端肠道细菌多样性丰富，和一些食肉目动物、奇蹄目动物末端肠道菌群差异明显且不同动物末端肠道菌群不一样。猕猴末端肠道菌群会随着年龄、身体状况等改变而变化。这些动物有氧条件下可培养肠道细菌类群丰富，且蕴含着很多未知或者潜在新物种。这些动物的纯培养肠道细菌可能对宿主的各种食物消化起着重要的作用，且其中一些细菌存在其他利用价值。

目录

声明

摘要

第1章绪论

1．1肠道微生物种类和分类

1．2肠道微生物形成和变化性

1．3不同肠道区段肠道细菌组成

1．4不同动物肠道细菌组成

1．5动物肠道细菌与其他一些环境细菌区别

1．6肠道细菌与宿主健康疾病

1．6．1肠道菌与癌症

1．6．2肠道菌和宿主免疫

1．6．3肠道菌与肥胖

1．7目前肠道细菌的一些应用价值

1．7．1益生菌和粪菌移植(Fecal microbiota transplantation；FMT)

1．7．2肠道菌相关化合物和基因

1．8非人灵长目动物肠道细菌研究现状

1．9本研究内容和意义

第2章一些灵长目、食肉目、奇蹄目动物末端肠道菌群和异同

2．1实验材料和方法

2．1．1样品采集

2．1．2粪便基因组DNA样品的制备及检测

2．1．3 16S rDNA的V4区PCR扩增和测序

2．1．4序列处理和分析

2．2结果和分析

2．2．1 DNA提取结果

2．2．2测序数据质控

2．2．3各种动物末端肠道菌群多样性

2．2．4主成分分析(Principal coordinates analysis；PCoA)和聚类分析(Unweighted pair-group average；UPGMA)

2．2．5各类动物末端肠道菌群异同

2．3本章小结和讨论

第3章猕猴末端肠道细菌多样性和变化性

3．1实验材料和方法

3．1．1样品采集

3．1．2粪便样品基因组DNA样品的制备及检测

3．1．3 16S rRNA基因V3+V4区扩增和测序

3．1．4序列处理和分析

3．2结果分析

3．2．1 DNA提取结果

3．2．2测序数据质控

3．2．3所有动物末端肠道菌群多样性

3．2．4主成分分析(PCoA)和聚类分析(UPGMA)

3．2．5 Spearman相关性分析

3．2．6各种条件下猕猴末端肠道细菌变化

3．3本章小结和讨论

第4章几种灵长类动物可培养末端肠道细菌多样性

4．1材料和方法

4．1．1样品采集

4．1．2分离过程和培养基

4．1．3菌种纯化保藏和初步鉴定

4．2实验结果

4．2．1所有动物可培养末端肠道细菌多样性及与免培养对应分析

4．2．2各个动物可培养末端肠道细菌多样性

4．2．3不同条件下猕猴可培养末端肠道细菌异同

4．2．4潜在新分类单元

4．3本章小结和讨论

第5章两株潜在新分类单元系统鉴定

5．1实验材料和方法

5．1．1形态和生理生化

5．1．2细胞化学指标分析

5．1．3分子分类分析

5．2结果和分析

5．2．1形态和生理生化

5．2．2细胞化学指标

5．2．3分子分类分析

5．2．4菌种描述

5．3本章小结和讨论

第6章一些菌株潜在应用价值探索

6．1活性检测

6．1．1实验材料和方法

6．1．2结果和分析

6．2五株链霉菌全基因草图测序

6．2．1测序菌株和程序

6．2．2结果和分析

6．3菌株100880次级代谢产物分离

6．3．1实验材料和方法

6．3．2结果及分析

6．4棒状杆菌产谷氨酸潜力试验及毒性基因检测

6．4．1实验材料和方法

6．4．2结果分析

6．5本章小结和讨论

第7章总结与展望

参考文献

致谢

攻读博士学位期间取得的学术成果

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