核糖核酸酶抑制因子的基因修饰对其活性的影响

摘要

核糖核酸酶抑制因子中至少有30个还原型巯基,使HRI具有防止脂质过氧化损伤的功能.用丙氨酸同时取代Cys328和Cys329可以提高HRI 7-9倍的抗氧化损伤能力.为了进一步了解双点突变的HRI是否能提高细胞内的抗脂质过氧化损伤能力,我们研究了双点突变后HRI和野生型HRI对过氧化氢损伤的大鼠神经胶质瘤细胞C6的影响,将Cys328Ala和Cys329Ala双点突变的HRI cDNA片段和野生型HRI cDNA片段重新构建逆转录病毒载体pLNCX,并采用脂质体的方法转染大鼠神经胶质瘤细胞系C6,经Western杂交检测证明双点突变的HRI在C6细胞中过表达.用不同浓度的H<,2>O<,2>分别作用于转染的突变型HRI和野生型HRI过表达的C6细胞及正常C6细胞,对比损伤前后三者的细胞存活率、MDA含量差别,以及细胞内抗氧化酶CAT、SOD的活性差别.实验结果表明,HRI可以通过巯基直接清除氧自由基造成的脂质过氧化损伤,也可以通过提高细胞内抗氧化酶的活性,清除过多自由基;而Cys328Ala和Cys329Ala双点突变的HRI因在两个半胱氨酸之间不能形成二硫键,可能稳定了整个HRI分子的立体结构,进而使突变型HRI在降低脂质过氧化损伤程度以及提高细胞内抗氧化酶活性的能力上较野生型HRI有所提高.为更好的了解HRI与Ang和RNase A的结合位点及它们之间高亲和性的结构基础,合理设计抗肿瘤血管新药.该文用PCR的方法在HRI cDNA 5'端去除30个碱基,并将此缺失突变的HRI的cDNA片段构建于质粒pPIC9K,电击转化入毕赤酵母(Pichia pastores)GS115中,进行分泌型表达.对表达产物进行亲和层析纯化.检测N端缺失突变的HRI对RNase A的亲和力及RNase A抑制活性的影响,结果表明,N-端缺失突变的HRI与RNase A的亲合力较野生型HRI降低一倍,但依然具有竞争性抑制RNase A的活性,表明HRI N-末端10个氨基酸残基对于RNase A活性的抑制并不重要,缺失后不影响HRI的活性.为了进一步了解N-端缺失10个氨基酸残基对HRI活性的改变,我们研究了突变后HRI和野生型HRI对过氧化氢损伤的大鼠神经胶质瘤细胞C6的影响,将HRI 5'端缺失30个碱基的HRI cDNA片段和野生型HRI cDNA片段重新构建逆转录病毒载体pLNCX,并采用脂质体的方法转染大鼠神经胶质瘤细胞系C6,经Western杂交检测证明N-端缺失突变的HRI在C6细胞中过表达.用不同浓度的H<,2>O<,2>分别作用于转染有突变型HRI和野生型HRI过表达的C6细胞及正常C6细胞,对比损伤前后三者的细胞存活率、MDA含量差别,以及细胞内抗氧化酶CAT、SOD的活性差别.实验结果表明,N-端缺失突变的HRI在降低脂质过氧化损伤程度以及提高细胞内抗氧化酶活性的能力上较野生型HRI有所下降.

目录

核糖核酸酶抑制因子的基因修饰对其活性的影响

第一章双点突变核糖核酸酶抑制因子在毕赤酵母中的表达及对其活性的影响

摘要

前言

材料

方法

结果

讨论

第二章N-末端缺失突变对核糖核酸酶抑制因子活性的影响

摘要

前言

材料和方法

结果

讨论

第三章双点突变核糖核酸酶抑制因子在大鼠神经胶质瘤细胞系C6中的过表达及对其抗H2O2损伤能力的影响

摘要

前言

材料

方法

结果

讨论

第四章N-端缺失突变核糖核酸酶抑制因子对H2O2损伤大鼠神经胶质瘤细胞系C6的影响

摘要

前言

实验材料和方法

结果

讨论

参考文献

第五章结论与展望

附录

第六章文献综述:外原基因在巴斯德毕赤甲基营养酵母（Pichia pastoris）中的表达

参考文献

致谢

三年学习期间发表和待发表论文情况