结核分枝杆菌Rv2032和Rv3127的克隆、表达与功能鉴定

摘要

该论文的目的是(1)从结核分枝杆菌中分别克隆Rv2032和Rv3127基因;(2)构建以大肠杆菌为宿主的表达质粒pET16b-Rv2032和pET16b-Rv3127和以分枝杆菌为宿主的表达质粒pVV2-Rv2032和pVV2-Rv3127;(3)分别在大肠杆菌BL21(DE30和耻垢分枝杆菌M.semgmatics Mc<'2>155菌株中表达目标蛋白以筛选高表达工程菌株;(4)鉴定Rv2032和Rv3127蛋白质的功能.该论文所获得的结果如下:1.扩增Rv2032和Rv3127基因从结核分枝杆菌H37R v菌株基因组数据库(http://genolist.pasteur.fr/TubercuList/)中获得Rv2032和Rv3127基因的核苷酸序列.根据核苷酸序列设计PCR引物,并在每一基因的上、下游引物中分别引入了NdeI和BamHI限制性内切酶位点.利用LA Taq DNA聚合酶成功地从H37Rv菌株基因组DNA中扩增了Rv2032和Rv3127基因,在Rv2032和Rv3127基因的PCR产物的两端分别携带NdeI和BamHI位点.2.克隆Rv2032和Rv3127基因和测定DNA序列将上述PCR产物连接到克隆载体pMD18-T的EcoRV位点,将连接产物转化到大肠杆菌DH5α菌株的感受态细胞中.用限制性内切酶酶切方法筛选出阳性重组质粒pMD18-Rv2032(＃3)和pMD18-Rv3127(＃3).对Rv2032和Rv3127基因进行DNA序列测定,测序结果与结核分枝杆菌H37Rv菌株基因组数据库中的Rv2032和Rv3127基因序列完全一致,表明用PCR技术扩增的Rv2032和Rv3127基因不存在任何碱基突变.3.构建表达质粒用NdeI和BamHI双酶切阳性重组克隆质粒pMD18-Rv2032(＃3)和pMD18-Rv3127(＃3),纯化Rv2032和Rv3127基因,将Rv2032和Rv3127基因分别连接到用于大肠杆菌的表达载体pET16b及用于分枝杆菌的表达载体pVV2的NedI和BamHI 位点.将连接产物转化到大肠杆菌NovaBlue菌株的感受态细胞中,用限制性内切酶酶切方法和PCR方法筛选出阳性重组表达质粒pET16b-Rv2032(＃1)和pET16b-Rv3127(＃1)以及pVV2-Rv2032(＃2)和pVV2-Rv3127(＃2).每一重组表达质粒中的目的基因产物的N端与表达质粒上的多聚组氨酸(His<,10>标记形成融合蛋白,便于目的蛋白的检测和纯化.4.Rv2032和Rv3127目的蛋白的表达1)目的蛋白在大肠杆菌中的表达2)目的蛋白在分枝杆菌中的表达5.聚阿伯糖水解酶活性的测定该课题利用分子克隆技术克隆了Rv2032和Rv3127基因,利用大肠杆菌表达了Rv2032和Rv3127目的蛋白.这一工作的完成为进一步用纯化的酶来优化酶促反应条件、研究酶促反应动力学特性提供了物质基础.

目录

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述分枝杆菌细胞壁结构及其聚糖的生物代谢

参考文献

致谢