小鼠胚胎发育过程中内皮和平滑肌标志物的表达变化

摘要

血管增殖失调是临床常见的病理过程，如动脉粥样硬化、同种异体移植后血管重塑、支架内再狭窄、经皮球囊血管成形术等，探讨血管平滑肌细胞(Vascular smOOth muscle eells，VSMCs)的起源有助于增生性血管病的治疗。以往认为胚胎的VSMCs起源于神经嵴和胚胎中胚层；新近发现VSMCs还可能起源于成体骨髓干细胞或祖细胞、外周血的单核细胞、骨骼肌的成体干细胞和内皮细胞(Endothelium eells，ECs)等。Yamashita J等的体外研究证实，胚胎干细胞来源的胎肝激酶-1(Fetal liverkinase-1，Flk-1)，即血管内皮生长因子受体-2阳性细胞在血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)作用下可分化为血管ECs，在血小板源性生长因子．BB作用下可分化为VSMCs，因此认为Flk-1阳性细胞是血管ECs和VSMCs的共同前体，然而该理论尚缺乏在体证据支持。我们通过对胚胎血管行Flk-1、血小板内皮细胞粘附分子(Plateletendothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1/CD31)、Ⅷ因子相关抗原及平滑肌α-肌动蛋白(Smooth Muscle α-actin，SM α-actin)免疫组织化学染色，探讨上述标志物在血管形成初期的表达时相及空间位置关系，为VSMCs的起源提供新的在体实验依据。 Flk-1主要分布于ECs、造血细胞及其前体细胞，已有报道Flk-1最早出现于小鼠胚胎6.5 d，在ECs及造血细胞的发育中发挥重要作用；在血管新生生理过程或肿瘤等病理过程中也可观察到Flk-1呈高表达，但小鼠植入前胚胎是否表达Flk-1迄今尚未见报道。本实验拟初步探讨Flk-1在小鼠植入前胚胎发育过程中的表达规律及其在胚胎发育中的作用。 1.获取8.5～18.5 d胚胎：将母鼠分别放入公鼠笼内过夜、交配。次日清晨检查到白色阴道栓者为怀孕鼠，该天记为怀孕第0.5d。在母鼠怀孕第8.5～18.5d，处死母鼠，取出胚胎。 2.获取植入前胚胎：母鼠腹腔内注射孕马激素10U，44～48h后注射人绒毛膜促性腺激素5U，随后将其分别放入公鼠笼内过夜、交配。12h获取单细胞期胚胎，36h获取2细胞期胚胎，48h获取4细胞期胚胎，60h获取8细胞期胚胎，84～96h获取囊胚。从超排卵母鼠的输卵管冲出单细胞期胚胎到8细胞期胚胎，从子宫中冲出桑椹胚和囊胚。 3.8.5～18.5 d胚胎标本置4﹪多聚甲醛(Paraformaldehyde，PFA)中室温固定3h，按常规脱水后石蜡包埋，制备横断面5μm厚度连续切片，挑选胸腔部分和腹腔部分的主动脉切片染色。 4.植入前胚胎经3 g/L聚乙烯基吡咯烷酮/磷酸盐缓冲液(Polyvinylpyrrolidone/phosphatebuffered saline，PVP/PBS)中洗涤，2.5﹪PFA室温固定15 min，置PVP/PBS液4℃保存，待用。 5.8.5～18.5 d胚胎切片行苏木素-伊红染色，观察背主动脉形态学变化。 6.8.5～18.5 d胚胎切片行Flk-1、CD31、Ⅷ因子相关抗原及SM α-actin免疫组织化学染色，观察胚胎发育过程中，背主动脉ECs及VSMCs标记物的表达变化。 7.收集植入前各期胚胎20个，采用mRNA Capture Kit试剂盒可捕获总mRNA，行Flk-1的反转录一聚合酶链(Reverse transcription polymerasechain reactiON，RT-PCR．)反应，观察Flk-1的表达变化规律。 8.植入前各期胚胎采用微滴操作行Flk-1全胚免疫荧光染色，激光共聚焦显微镜下观察Flk-1的表达及定位。 9.将8细胞期胚胎置于含5mg/L Flk-1中和抗体的胚胎培养液中培养12h后，加入绿色荧光标记的羊抗大鼠二抗，观察透明带是否能通过抗体等大分子物质。 10. 取8细胞期胚胎随机分3组，实验组加入Flk-1中和抗体5 mg/L至胚胎培养液中，空白对照组为胚胎培养液，抗体对照组加入非中和抗体5mg/L，至胚胎培养液中，培养36h后计算囊胚形成率。采用X<'2>检验对数据作统计学分析，P<0.05有统计学意义。 11. 8细胞期胚胎采用微滴操作行VEGF全胚免疫荧光染色，激光共聚焦显微镜下观察VEGF的表达及定位。 1．胚胎8.5 d在胸腔部分和腹腔部分均可见左、右背主动脉，9.5 d腹腔部分可见单一背主动脉，而胸腔部分心脏水平仍然维持左、右背主动脉的形态；8.5～9.5 d背主动脉呈现Flk-1阳性、CD31阳性、Ⅷ因子相关抗原阴性、SM α-actin阴性。 2．胚胎10.5 d左、右背主动脉在腹腔部分和胸腔下部为一条背主动脉，但仍为单层细胞围成的管腔，而在心房水平仍然可见左、右背主动脉，且呈现SM α-actin、Flk-1、CD31、Ⅷ因子相关抗原均阳性。 3．胚胎11.5 d背主动脉管壁发育为多层，内层细胞呈Flk-1阳性、SMα-actin阴性，外层细胞呈Flk-1阴性而SM α-actin阳性，血管与周围间充质无明显分界，背主动脉管壁周围可见散在SM α-actin阳性细胞。 4．胚胎11.5 d之后，背主动脉管壁VSMCs数量增多且由不规则型转变为纺锤型，内层ECs继续呈Flk-1阳性、SM α-actin阴性，外层VSMCsFlk-1阴性、SM α-actin阳性，血管与周围间充质分界清楚，背主动脉血管周围无散在SM α-actin阳性细胞。 5．在植入前小鼠胚胎中8细胞期胚胎Flk-1表达最高，在RT-PCR反应28个循环时只有8细胞期胚胎可检测到Flk-1；循环数增加到32个时4细胞期胚胎也检测到Flk-1表达。在单细胞期、2细胞期、桑椹胚期和囊胚期胚胎均未检测到F1k-1表达。 6．4细胞期胚胎的细胞膜上可见绿色荧光，主要定位于胚胎的外缘和细胞交界处，胞浆和胞核均未见绿色荧光；8细胞期胚胎细胞表面的绿色荧光较4细胞期胚胎增强，蛋白定位同4细胞期胚胎。单细胞期、2细胞期、桑椹胚期、囊胚期表达呈阴性。 7．取8细胞期胚胎在含Flk-1中和抗体5 mg/L的胚胎培养液中培养12h后加入二抗，发现绿色荧光出现在胚胎的透明带内部，说明透明带可通过抗体等大分子物质。 8．取8细胞期胚胎在含Flk-1中和抗体5 mg/L的胚胎培养液中培养，各组36 h囊胚形成率如下：空白对照组80.95﹪(17/21)，抗体对照组81.81﹪(18/22)，实验组40.00﹪(10/25)。空白对照组和抗体对照组36 h囊胚形成率无统计学差异。实验组与空白对照组之间有统计学差异。但两实验组胚胎在48 h时仍可发育为囊胚。 9．8细胞期胚胎VEGF表达呈阳性，蛋白表达定位于胚胎细胞的胞浆内。 1.胚胎背主动脉的VSMCs可能最早起源于Flk-1、CD31阳性细胞，后期可能来源于周围间充质细胞的募集分化。 2.在小鼠植入前胚胎发育不同阶段Flk-1表达不尽相同，Flk-1的表达可能与促进植入前胚胎发育有关。

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摘要

前言

第一部分 小鼠胚胎背主动脉发育过程中内皮和平滑肌标志物表达时相及其变化

第二部分 血管内皮生长因子受体-2在植入前小鼠胚胎发育中的表达变化

结论

参考文献

综述 血管内皮生长因子及其受体与胚胎发育

致谢

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