应用RQ-RT-PCR方法评估急性粒细胞白血病部分分化型（M2）患者MRD状态

摘要

目的：探讨建立应用实时荧光定量RT-PCR(Real-Time QuantitativeReverse Transcription Polymerase chain Reaction，RQ-RT-PCR) 检测AML1/ETO融合基因的RNA标准品的方法，并以此作为工具监测急性粒细胞白血病部分成熟型(M2)患者微小残留病(Minimal Residual Disease，MRD)的状态，为判断预后、预测复发、探索强化治疗时机、最终实现个体化治疗提供依据。 方法：1、提取患者标本的总RNA，根据已知序列设计特异性引物：2、应用定性的RT-PCR在患者标本中筛选AML1/ETO融合基因，经琼脂糖凝胶电泳确认后回收；3、回收的含有目的基因的PCR产物与质粒PMD-18T连接后，转入大肠杆菌感受态细胞JM-109；4、将大肠杆菌感受态细胞接种于AIX选择性平板37℃过夜培养扩增，挑取阳性菌落提取质粒；5、以质粒为摸板进行PCR反应，经电泳确认连接成功的质粒提取DNA送宝生物公司进行测序确认；6、将含有目的基因的阳性质粒经HindⅢ酶切后进行体外转录，电泳确认后测取OD值，得到RNA标准品10<'10>拷贝数；7、应用RQ-RT-PCR．验证标准品的性能并对此方法进行方法学评价；8、对37例患者骨髓或外周血单个核标本进行了检测，并对其中5例患者进行了跟踪监测；9、应用流式细胞仪检测患者白血病相关的免疫表型及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bcl-x<,L>及Bax，并对1例AML1/ETO融合基因阴性的患者进行了跟踪监测。 结果：1、调取目的基因AML1/ETO的片段长度为402bp，回收并经载体扩增后测序确认为所需的目的基因；2、构建的RNA标准品可以得到线性好的标准曲线(方程为Y=-3.477*LOG(X)+41.63)，扩增效率较高(E=93.9﹪)，融解曲线显示特异性较好，融解温度在83℃±1℃，表明标准品构建成功；3、荧光定量PCR检测目的基因AML1/ETO的敏感性为10<'-5>，重复性较好，批内变异为6﹪，批间变异为10﹪，特异性较高； 4、患者初诊组及复发组的目的基因AML1/ETO的相对值的平均值高于完全缓解组(CR)，P<0.05，且存在个体差异；5、随访的患者，初诊时目的基因AMLl/ETO的相对值很高，完全缓解时降低，复发时明显升高，初诊和CR两个时间点目的基因AML1/ETO的相对值相差2个数量级以上病人的复发危险性相对较小，如果基因AML1/ETO的相对值持续升高，提示患者的生存期较短预后较差；6、经治疗持续未缓解的病人跟踪监测凋亡相关蛋白Bel-2/Bax表达比值呈上升趋势；7、患者体内CD13和HLA-DR表达稳定，且与病情发展相关，可作为无特异性融合基因的患者检测MRD的补充手段；8、对患者21免疫表型跟踪监测表明在治疗过程中出现了表型漂移。 结论：RO-RT-PCR方法检测AML1/ETO。融合基因的敏感性和特异性较高，可信度和稳定性较好：融合基因表达水平的改变与临床疾病进展关系一致，对AML1/ETO融合基因阳性的患者MRD的定量动态监测有助于反映患者体内白血病细胞负荷，初步评价早期治疗效果及药物的敏感性，预测者复发危险度，并有望成为确定强化治疗的时机、延长病人完全缓解期的重要手段。对于不存在特异性融合基因的这部分患者可利用免疫学方法进行弥补。

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综述急性髓系白血病的微小残留病栓测的研究进展

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