兔关节软骨细胞的分离、培养及鉴定

摘要

目的：优化兔关节软骨细胞分离方法，探索其体外单层培养过程条件及端粒、生物学功能学特性的变化。
　　 方法：选用4周龄雄性、健康、新西兰大白兔的关节软骨，采用机械、双酶消化法进行分离得到关节软骨细胞。测定细胞存活率，并在含有10％胎牛血清的DMEM高糖培养基中进行体外单层培养。待细胞融合率达到85%至90%时，用胰蛋白酶消化收集并以相同密度铺板传代。逐代观察细胞形态及应用MTT法绘制细胞生长曲线：同时采用甲苯胺蓝染色和RT-PCR方法动态研究各代关节软骨细胞的蛋白多糖，Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白与端粒酶因水平的表达变化。
　　 结果：本方法兔关节软骨细胞收集过程简便、高效，平均每克软骨可得到2×106个细胞。在体外单层培养的过程中，随传代次数增加，软骨细胞传代时间变长，细胞形态逐渐向“纤维样”细胞转化。Ⅰ型胶原蛋白基因水平的表达呈递增趋势，Ⅱ型胶原蛋白与端粒基因水平的表达呈递增趋势，细胞外基质蛋白多糖逐渐减少。前三代细胞具有较高的生物学及功能学特性表达，四代后主要表现为Ⅰ型胶原的高表达，而软骨细胞所特有的Ⅱ型胶原及蛋白多糖基本消失。整个趋势呈现去分化。
　　 结论：1．关节软骨细胞机械、双酶获取方法简便易操作，可获取大量存活率高的软骨细胞。
　　 2．体外单层培养的兔关节软骨细胞前三代表型稳定，生物学及功能学特性表达良好。