榄香烯对小鼠肝癌高、低淋巴道转移系Hca-P/L6和Hca-P生物学特性影响的比较研究

摘要

目的：恶性肿瘤是危害人类健康最严重的一类疾病，寻找高效低毒的天然抗肿瘤药物对提高化学治疗水平具有重要意义。榄香烯(elemene)是我国自行研制开发的国家二类非细胞毒性抗肿瘤药物。它是从姜科植物温郁金（莪术）的挥发油成分莪术油中分离出的以β-榄香烯(β-elememe)为主要成分的榄香烯类化合物，对体内外多种肿瘤细胞具有较强抑制和杀伤效应，对多种肿瘤有确切疗效。但榄香烯抗肿瘤生长与转移的机制尚不十分清楚。肿瘤的发生、发展和转移可能与膜脂质的组分、结构、功能和理化性质的异常密切相关。因此，引起细胞膜脂质的变化可能是药物抗肿瘤及其转移的作用机制之一。本研究以小鼠腹水型肝癌高、低淋巴道转移系(HCa-P/L6和HCa-P)为研究对象，以活细胞萃取与气相色谱-质谱联用(gas chromatography and mass spectrometry, GC-MS)技术分析比较榄香烯乳注射液与两个细胞系作用的有效成分；以高效液相色谱(high-performance liquid chromatography， HPLC)技术对膜磷脂成分进行分离与定量分析，通过比较高、低淋巴道转移细胞系的膜磷脂质指纹谱图，探索细胞膜磷脂与肿瘤转移力的相关性及磷脂在榄香烯抗肿瘤转移作用中的机制，为阐明肿瘤淋巴道转移和癌转移诊断试剂及抗转移药物开发奠定基础。这项研究既有理论意义，又有潜在的应用价值，同时也为开发价格低廉、高效低毒的天然抗肿瘤药物提供了可靠的理论依据。
　　 方法：采用MTT法测定榄香烯对HCa-P/L6和HCa-P两个细胞系的细胞毒性，确定无细胞毒性药物最大剂量，计算半数抑制率；以无细胞毒性药物最大剂量的榄香烯处理两种细胞，观察榄香烯对两种细胞生物学特性的影响：绘制各种细胞的生长曲线并计算各自的群体倍增时间；采用流式细胞仪检测榄香烯对两细胞系的细胞周期分布的影响；采用活细胞萃取/GC/MS技术，检测榄香烯与肿瘤细胞作用的有效成分；以差速离心、梯度离心和液-液萃取方法分离、提取肿瘤细胞膜脂质，以HPLC技术检测榄香烯与肿瘤细胞作用后细胞膜磷脂的变化。
　　 结果：
　　 1.20～100μg/mL的榄香烯作用HCa-P/L6和HCa-P48h后，榄香烯对两种细胞生长均有明显的抑制作用（P＜0.05），且呈量效关系；榄香烯对HCa-P/L6的抑制范围广于对HCa-P。榄香烯对HCa-P/L6的IC50为37.3μg/mL，对HCa-P的IC50为70μg/mL。
　　 2．当榄香烯浓度为10μg/mL时，HCa-P/L6和HCa-P的细胞存活率分别为90％和98.6%，存活率大于90%，此浓度为非细胞毒性最大剂量。
　　 3． HCa-P/L6和HCa-P的细胞生长曲线和群体倍增时间没有差异：10μg/mL的榄香烯可使HCa-P/L6和HCa-P两个细胞系的群体倍增时间增加，且有差异(P＜0.05)；生长曲线显示10μg/mL的榄香烯明显抑制两个细胞系的生长。
　　 4． HCa-P/L6和HCa-P两个细胞系的细胞周期分布不同，HCa-P/L6处于分裂状态的细胞多于HCa-P。10μ,g/mL榄香烯处理两细胞系48h后两个细胞系的细胞周期分布相近，均使HCa-P/L6和HCa-P细胞周期阻滞于S期，而且对HCa-P/L6的阻滞作用大于对HCa-P。
　　 5．榄香烯诱导HCa-P/L6和HCa-P的细胞凋亡，促进HCa-P/L6细胞凋亡的程度大于HCa-P。
　　 6.10μg/mL榄香烯处理两细胞系48h，应用活细胞萃取/GC-MS联用技术从HCa-P/L6和HCa-P细胞中均检测出8种活性成分，包括β-，γ-，δ-榄香烯，β-榄香烯是主要活性成分，HCa-P/L6中β-榄香烯等活性成分含量明显低于HCa-P。
　　 7.10μg/mL榄香烯处理两细胞系48h用HPLC分析加药前后两细胞系中磷脂变化，发现两细胞中PE、PI两种磷脂含量均减少，且HCa-P/L6较HCa-P减少明显。
　　 结论：
　　 1．榄香烯呈剂量依赖性抑制HCa-P/L6和HCa-P细胞生长，IC50HCa-P/L6较HCa-P低；10μg/mL榄香烯可使HCa-P/L6和HCa-P群体倍增时间延长，使细胞周期重新分布，两细胞系均阻滞于S期，且HCa-P/L6较HCa-P阻滞明显。HCa-P/L6较HCa-P对榄香烯敏感。
　　 2．榄香烯与HCa-P/L6和HCa-P细胞作用的活性成分相同，包括β-，γ-，δ-榄香烯，β-榄香烯是主要活性成分，但HCa-P/L6中β-榄香烯含量明显低于HCa-P。
　　 3．榄香烯使两个细胞系中PE、PI含量均减少，且HCa-P/L6较HCa-P减少明显，表明榄香烯抑制肿瘤生长和转移可能与膜磷脂变化相关。