CXCR1/CXCR2受体拮抗剂-G31P对前列腺癌的抑制作用及机制研究

摘要

目的:前列腺癌的发生发展是一个十分复杂的过程，肿瘤细胞能量代谢改变以及新生血管的产生是肿瘤发生发展的两大重要因素，在恶性肿瘤生长、侵袭以及转移中发挥重要作用的各种趋化因子及其受体也正逐渐引起国内外学者的普遍关注。CXCR1和CXCR2是研究较多的趋化因子受体，文献报道它们在膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、黑色素瘤等肿瘤细胞中过表达。采用抗体封闭则可以抑制肿瘤细胞生长和转移。我们之前采用基因定点突变而研制出一种人CXCL8类似物—CXCL8(3-72)K11R/G31P(G31P)。G31P能够同CXCL8受体CXCR1和CXCR2高亲和性结合，但并无生物学活性，从而同时阻断与CXCR1和CXCR2受体结合的所有趋化因子。本实验以人雄激素非依赖性前列腺癌细胞系PC-3作为研究对象，通过体内及体外实验研究G31P对人前列腺肿瘤PC-3的增殖、粘附、凋亡、转移和血管新生等方面的生物学行为的影响及其相关机制。
　　 方法:本实验选取雄激素非依赖性前列腺癌细胞系PC-3作为研究对象，体外采用CCK-8法、AnnexinV-FITC方法研究G31P对PC-3细胞生长和凋亡的作用;通过ECM基质粘附实验、划痕实验和Transwell小室侵袭实验研究G31P对PC-3细胞粘附和转移的影响。体内建立绿色荧光蛋白(GFP)标记的人雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞裸鼠原位移植瘤模型，观察G31P对裸鼠前列腺癌原位移植瘤的体积、重量、血管密度和裸鼠体重的影响，TUNEL法分析G31P对裸鼠前列腺癌原位移植瘤凋亡的影响，免疫组织化学（免疫组化）法检测前列腺癌组织SURVIVIN、MMP-9、MMP-2、VEGF和NF-κB表达水平，探讨G31P在前列腺癌凋亡调控、转移和血管生成中的有效机制。
　　 结果:
　　 1.CCK-8结果显示G31P对PC-3细胞的抑瘤作用随着浓度的增加而增大，与对照组比较，G31P0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL作用1天后，G31P对人前列腺癌PC-3细胞的抑瘤率分别为5.07％±4.4、20.29％±4.4、22.83％±4.1和38.04％±1.6;作用3天后，G31P对人前列腺癌PC-3细胞的抑瘤率分别为2.27％±9.6、6.14％±9.4、3.87％±2.7和16.02％±6.8;作用5天后，G31P对人前列腺癌PC-3细胞的抑瘤率分别为6.08％±4.3、6.65％±1.9、10.13％±2.6和12.73％±3.2。其中G31P100ng/mL作用1天、3天和5天与对照组相比较差异具有统计学意义(作用1天P＜0.01、3天P＜0.01、5天P＜0.05)。
　　 2.AnnexinV-FITC染色结果显示对照组、G31P10ng/mL和G31P100ng/mL处理组的正常细胞均大于90％，对照组与G31P100ng/mL处理组相比正常细胞数具有明显差异(P＜0.05)，而对照组与G31P10ng/mL处理组相比则正好相反(P＞0.05)。
　　 3.将ECM包被于96孔板上，用0ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL和100ng/mLG31P预处理24h的细胞进行ECM基质粘附实验，其相对的细胞粘附能力经CCK-8法检测，粘附率经计算后分别为100％±14.05、59.57％±13.32(P＜0.01)、32.34％±23.35(P＜0.01)、40.85％±19.43(P＜0.01)和51.49％±15.50(P＜0.01)。
　　 4.细胞划痕实验结果显示G31P0ng/mL10ng/mL和100ng/mL处理组作用细胞48h的迁移率分别为62.83％±20.71、44.74％±21.2(P＜0.05)、44.03％±14.14(P＜0.05);G31P0ng/mL、10ng/mL和100ng/mL处理组作用细胞72h的迁移率分别为75.50％±23.64、52.53％±21.92(P＜0.05)、50.17％±22.43(P＜0.05)。
　　 5.0ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL和100ng/mLG31P预处理24h的细胞进行Transwell小室侵袭实验，穿膜细胞数分别为34±6、35±4、33±5、33±4和31±6个，随着G31P处理浓度的逐渐增加，其穿膜细胞数虽呈减少趋势，但与对照组相比差异均不具有统计学意义(P＞0.05)。
　　 6.人雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞裸鼠原位移植瘤的模型体内实验显示，对照组(100μlN.S)、G31P处理组(0.5mg/kg)和紫杉醇处理组(15mg/kg)分别于给药后0天、12天、18天和24天在荧光影像系统下测量小鼠的原位肿瘤体积，G31P处理组从给药第12天起与对照组相比显著抑制前列腺肿瘤的体积(P＜0.05)，给药后第18天这种抑制作用更加明显(P＜0.01)。
　　 7.给药后第24天，处死动物，切取原发肿瘤。电子天平称量原发肿瘤的重量。对照组、G31P处理组和紫杉醇处理组原发肿瘤重量分别为2.31±1.089、1.4±0.89g和1.38±0.87g。与对照组相比G31P处理组(P＜0.05)和紫杉醇处理组(P＜0.05)均明显抑制前列腺肿瘤的重量，但这两组间无显著差异。
　　 8.对照组、G31P处理组和紫杉醇处理组分别于给药后0天、7天、14天、21天和24天称裸鼠体重，各组体重未发现明显差异(P＞0.05)。
　　 9.处死动物后打开腹腔在荧光影像系统下观察淋巴结（腰淋巴结、肠系膜淋巴结、远处淋巴结）、胰腺、骨等部位的转移。采用x2检验，
　　 与对照组相比，G31P处理组和紫杉醇处理组淋巴结（腰淋巴结、肠系膜淋巴结、远处淋巴结）转移略有减少，但无统计学意义;G31P处理组胰腺转移则明显减少(P＜0.05)。
　　 10.与对照组(1.26±0.46)相比G31P处理组明显抑制前列腺肿瘤的血管新生(0.49±0.12，P＜0.05)，紫杉醇处理组也能明显抑制前列腺肿瘤的血管新生(0.41±0.18，P＜0.05)，但这两组间无显著差异。
　　 11.免疫组化结果经Image-Pro6.0软件计算每张照片的累积光密度(IOD)，与对照组相比G31P处理组MMP-9(P＜0.01)、VEGF(P＜0.01)和NF-κB(P＜0.01)的表达具有统计学意义;SURVIVIN(P＞0.05)和MMP-2(P＞0.05)的表达无统计学意义。
　　 结论:
　　 1.G31P在体内及体外实验均能明显抑制雄激素非依赖性前列腺癌细胞系PC-3的增殖，并且这种抑制作用存在剂量依赖关系。这种抑制作用并非通过直接杀死肿瘤细胞或诱导人前列腺癌PC-3细胞发生凋亡实现的。
　　 2.G31P体外实验能抑制雄激素非依赖性前列腺癌细胞系PC-3的粘附和转移，并且存在剂量时间依赖关系。
　　 3.G31P体内实验对雄激素非依赖性前列腺癌细胞系PC-3的胰腺和肝部转移有抑制作用。
　　 4.G31P体内实验能抑制雄激素非依赖性前列腺癌细胞系PC-3的血管生成。
　　 5.G31P对减轻裸鼠肿瘤相应症状和改善裸鼠生存质量无明显作用。
　　 6.G31P对前列腺癌转移的抑制作用可能与其能够下调MMP-9的表达相关，而与MMP-2无关。
　　 7.G31P对前列腺癌血管新生的抑制作用可能与其能够下调VEGF和NF-κB的表达相关，而与SURVIVIN无关。这一点同紫杉醇处理组相同。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 G31P对前列腺癌增殖及凋亡的影响

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 G31P对前列腺癌粘附转移的影响及其机制研究

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三部分 G31P对前列腺癌血管新生的影响及机制研究

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述

附录

致谢