基于抗体多维数据的解析探讨丙型肝炎病毒抗体亲和力在病程中的动力学变化及与HLA多态性的关联

摘要

目的:采用抗体多维数据分析，建立HCV抗体亲和力的检测方法，并探讨丙型肝炎病毒抗体亲和力、物质量及总活性动力学变化及其与病毒量、机体损伤程度以及疾病不同阶段的联系。HCV感染患者HLA-A，HLA-B，HLA-DRB1基因型别与疾病过程的联系以及其作用机制。
　　方法:1、采用重组乙型肝炎疫苗反复三次皮下注射免疫兔子，第一次注射一周后采集兔子血清，获得低亲和力抗体动物血清;第三次注射两周后采集兔子血清，获得高亲和力抗体动物血清，倍比稀释血清，采用双抗原夹心酶联免疫吸附实验测定anti-HBs。随机收集临床诊断为HCV感染患者血清106例，采用化学发光微粒子免疫检测法测定HCV抗体，PCR-荧光探针法检测HCV-RNA，同时检测ALT、AST、ALB等临床常用检测指标。根据ALT、AST水平以及HCV-RNA水平各分三组，比较分析组间抗体亲和力、抗体总活性及抗体物质量的变化。2、随机收集临床诊断为HCV感染患者血清328例，采用化学发光微粒子免疫检测法测定HCV抗体，PCR-荧光探针法检测HCV-RNA，同时检测ALB。根据疾病阶段分为慢性肝炎组和肝硬化组，慢性肝炎组又根据患者ALB和HCV-RNA水平分为:ALB正常&HCV-RNA阴性组(好转恢复阶段)和其他组(进展阶段)。分析比较组间抗体亲和力、抗体物质量及抗体总活性的变化。3、随机收集临床诊断为HCV感染患者血清104例及健康对照200例，采用化学发光微粒子免疫检测法测定HCV抗体，PCR-荧光探针法检测HCV-RNA，同时检测血清ALB水平，采用测序方法(Sequence based typing，PCR-SBT)进行HLA基因型的鉴定。比较分析不同HLA型别间ALB水平、抗体亲和力、抗体物质量及抗体总活性的变化。4、采用网上搜索数据库结合Discovery Studio(DS)软件来分析预测NS3和HLA-DRB1*09，HLA-A*02,HLA-A*33,HLA-B*58,HLA-DRB1*07,HLA-DRB1*13这6种HLA蛋白分子之间的相互作用。数据库包括美国国立医学图书馆文献检索系统NCBI，蛋白质结构数据库PDB以及PROSITE数据库。
　　结果:1、雌兔第1次免疫后血清抗体亲和力为0.522，第2次为0.826，第3次为0.896;雄兔第1次免疫后血清抗体亲和力为0.816，第2次为0.846，第3次为0.972，均呈逐渐升高趋势，与抗体亲和力成熟规律一致。2、ALT、AST正常组的抗体物质量明显低于任一异常组、均异常组(p＜0.05)，而抗体亲和力则明显高于任一异常组、均异常组(p＜0.05)。抗体总活性在三组中比较，均没有显著性差异(p＞0.05)。3、根据HCV-RNA水平，将ALT、AST均正常组(53例)进一步分组为HCV-RNA阴性组和HCV-RNA阳性组。HCV-RNA阴性组的抗体总活性、抗体物质量均明显低于HCV-RNA阳性组(p＜0.05)，而抗体亲和力却明显高于HCV-RNA阳性组(p＜0.05)。4、HCV-RNA阴性组的抗体总活性、抗体物质量均明显低于低病毒载量、高病毒载量组(p＜0.05)，而抗体亲和力则明显高于低病毒载量、高病毒载量组(p＜0.05)。5、以HCV-RNA阳性为因变量，抗体亲和力、抗体物质量和抗体总活性为自变量，进行logistic回归分析，HCV-RNA水平与抗体亲和力呈负相关(p＜0.05)。6、ALB正常&HCV-RNA阴性组的抗体亲和力明显高于慢性肝炎其他组和肝硬化组(p＜0.05)，而抗体物质量明显低于慢性肝炎其他组和肝硬化组(p＜0.05)，抗体总活性在三组中比较没有显著性差异(p＞0.05)。7、抗体亲和力和抗体物质量的ROC曲线下面积分别是0.816、0.811，均显示了较高的诊断效能，明显高于传统的抗体检测(ROC曲线下面积为0.581)。抗体亲和力对于区分丙肝感染进展阶段(HCV-RNA阳性)和好转阶段(HCV-RNA阴性)的最佳诊断临界点为0.873，抗体亲和力越高，病毒复制越少。8、ALB正常&HCV-RNA阴性组中，高抗体亲和力(≥0.873)的比例明显高于慢性肝炎其他组和肝硬化组p＜0.05)。9、HCV-RNA(+)的血清被含有高亲和力抗体的血清中和后，1gRNA明显低于中和前的水平(p＜0.05)。10、在HCV患者和健康对照组中鉴定出8种HLA型别具有显著性差异(p＜0.05)，分别是HLA-A*02，HLA-B*39，HLA-DRB1*09, HLA-DRB1*11, HLA-A*33, HLA-B*58, HLA-DRB1*07,HLA-DRB1*13。其中HLA-A*02,HLA-B*39,HLA-DRB1*09,HLA-DRB1*11在HCV患者中阳性率明显低于健康对照组，而HLA-A*33，HLA-B*58，HLA-DRB1*07，HLA-DRB1*13则明显高于健康对照组(p＜0.05)，提示HLA-A*02，HLA-B*39，HLA-DRB1*09，HLA-DRB1*11为丙肝感染的抵抗基因，而HLA-A*33，HLA-B*58，HLA-DRB1*07，HLA-DRB1*13则是丙肝感染的敏感基因。11、在上述8种HLA型别中，血清ALB水平在HLA-A*02，HLA-A*33，HLA-B*39，HLA-DRB1*07，HLA-DRB1*11，HLA-DRB1*13基因携带者与非携带者间并无差异(p＜0.05)，仅HLA-B*58和HLA-DRB1*09携带者与非携带者的ALB水平明显不同，前者p=0.015，后者p=0.003，均＜0.05，但仅有HLA-DRB1*09在交叉验证中仍然具有显著性差异，p=0.017，说明HLA-DRB1*09不仅是丙肝感染的抵抗基因，还在阻碍ALB水平下降及疾病进展的过程中起到保护作用。12、HLA-A位点基因频率(高分辨)与抗体亲和力呈正相关，提示基因频率越高，抗体亲和力越强。13、对携带HLA-A*02，HLA-B*39，HLA-DRB1*09，HLA-DRB1*11，HLA-A*33，HLA-B*58，HLA-DRB1*07，HLA-DRB1*13基因型别的患者进行抗体亲和力、抗体物质量以及抗体总活性的比较，由于HLA-B*39仅有1例阳性患者，HLA-DRB1*11只有4例阳性患者，故不对此两种基因型别进行比较。结果显示，按抗体亲和力排序，HLA-A*33＞HLA-B*58＞HLA-DRB1*07＞HLA-A*02＞HLA-DRB1*09＞HLA-DRB1*13。14、生物信息学角度的亲和力分析结果是:HLA对HCV NS3的亲和性排序为:HLA-B*58＞HLA-A*33＞HLA-DRB1*09＞HLA-DRB1*07＞HLA-A*02＞ HLA-DRB1*13。
　　结论:1.HCV抗体多维数据解析方法成立，HCV感染患者抗体亲和力、抗体总活性、抗体物质量的变化有可能反应肝细胞损伤及病毒载量的变化，具有一定的临床应用价值。2.HCV抗体多维数据解析发现，抗体亲和力与病情联系密切，优于传统实验室仅检测抗体总活性的方法。抗体亲和力在疾病转归中可能有一定的指示作用，具有较高的诊断效能，高亲和力抗体可能有利于疾病的好转，测定抗体亲和力将有助于临床医生判断疾病的预后。3.HLA多态性与丙型肝炎发生发展过程及HCV抗体亲和力高低有关，基因频率高(进化保守)，可能越有利于产生高亲和力的抗体。