SNAP-tag荧光探针与细胞内蛋白标记应用研究

摘要

蛋白质是细胞的重要组成部分，是生命活动的主要承担者。蛋白质的种类繁多，至今还有很多蛋白的性质未知，因此，对活细胞内蛋白质进行特异性荧光标记的技术应运而生。蛋白荧光标记技术因能够可视化的观测活细胞内蛋白质的结构与功能而被科学家们广泛应用。目前常用的蛋白荧光标记技术包括基因编码的荧光蛋白法、非天然氨基酸法和自标记蛋白标签技术。但是荧光蛋白存在分子量较大、荧光光谱单一等缺点，而非天然氨基酸法前期基因改造复杂使其应用存在一定的局限性。因此自标记蛋白标签技术被广泛的应用于研究活细胞中蛋白质的定位和动态功能。至今，已经开发了各种蛋白质标签以研究活体中的蛋白质系统，SNAP- tag是其中最优秀的融合标签之一。SNAP- tag是人源DNA烷基转移酶（hAGT）的变体，它能够专一性的与 O6-苄基鸟嘌呤（O6-benzylguanine，BG）及其衍生物共价连接。目前，各种连接BG底物的荧光探针已被设计出来，而且能专一、快速、不可逆地与SNAP–tag共价连接，这使其广泛应用于药物监测、蛋白质-蛋白质相互作用、荧光传感器、和超分辨显微镜。虽然已经发现了很好的荧光探针，但是由于背景光较强这些探针需要在成像之前清除。这不仅耗费时间，而且这种清洗可能会影响实时监测一些分子内部的活动（例如受体-配体结合、内吞作用、物质运输等）。此外，因为多余的荧光探针容易在各种细胞器中堆积，我们很难做到完全清除。因此，为了克服这些困难，开发了新的具有开关效应的荧光探针。本文采用SNAP-tag蛋白标签技术，用新型的荧光探针标记体内的蛋白，能够在免洗的条件下实时监控蛋白在细胞内的分布。基于此，本论文主要做了以下工作：
　　首先，基于荧光团的环境敏感与淬灭机制，我们设计合成了一系列基于1,8-萘酰亚胺荧光团的荧光探针BGAN-R（R=2C、8C、12C、DM）。通过荧光检测、动力学检测等一系列实验我们发现BGAN-2C能够快速、专一的与SNAP-tag共价反应，并且荧光显著增强。该探针细胞毒性小，在活细胞成像实验中，其能够快速地标记细胞内特定的蛋白质。
　　随后，基于光诱导电子转移机制我们设计合成了BGAN-DPA探针。通过荧光检测、动力学等研究，发现BGAN-DPA与SNAP-tag蛋白结合后荧光显著增强。并且结合后的蛋白-探针复合物对铜离子有专一性响应。最后将BGAN-DPA应用到HEK293细胞的生物成像研究中，在免洗条件下实现了细胞内线粒体上蛋白的标记及铜离子的检测。
　　综上所述，通过设计合成的新型荧光探针，实现了SNAP-tag蛋白在细胞内的可视化追踪以及细胞内铜离子的检测，并且不需要任何洗涤过程。

目录

声明

(一) 前言

第一章 基于环境敏感与淬灭机制的SNAP - tag探针及其细胞内蛋白的标记

第一部分 荧光探针的合成

1 材料

2 实验方法

第二部分 SNAP - tag蛋白的表达、纯化与表征

1. 材料

2. 实验方法

3. 实验结果

4. 讨论

第三部分 SNAP - tag蛋白的体外标记与光谱测定

1. 材料

2. 实验方法

3. 实验结果

4. 讨论

第四部分 荧光标记的SNAP - tag 蛋白在生物学方面的应用

1. 材料

2. 实验方法

3. 实验结果

4. 讨论

第二章 光诱导电子转移型SNAP - tag探针与细胞内铜离子的检测

第一部分 荧光探针的合成

1 材料

2 实验方法

第二部分 SNAP - tag 蛋白的表达、纯化与表征

第三部分 SNAP - tag蛋白的体外标记与光谱测定

1. 材料

2. 实验方法

3. 实验结果

4. 讨论

第四部分 荧光标记的SNAP - tag蛋白在生物学方面的应用

1.材料

2. 实验方法

3. 实验结果

4. 讨论

参考文献

综述:SNAP-tag荧光探针用于免洗蛋白标记的研究进展

附录（化合物的核磁谱图）

攻读学位期间发表论文情况

致谢