miR-130b调控人骨髓间充质干细胞成骨和成脂分化平衡的作用研究

摘要

目的：骨质疏松症（Osteoporosis，OP）属于一类机体代谢性、全身性的骨骼病变，以骨量下降、骨微结构受损及骨脆性上升为主要的病理特征，最终导致骨强度降低从而容易诱发不同程度的骨折。临床表现主要为病理性骨折和腰背痛，多发生在中老年人。随着世界人口老龄化的加速，老年性骨质疏松症及其所引起的骨折越来越受到全球的关注。老年性骨质疏松的特点是骨量减少和骨髓中脂肪蓄积，这种平衡紊乱源于骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal stem cells，BMSCs)成骨和成脂分化的失平衡。骨髓间充质干细胞(BMSCs)这类干细胞能够发挥多向分化且自我更新的功能，其广泛存在于人体和其他生物的骨髓组织中。它能够在一定条件下分化成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等。BMSCs作为成骨细胞和脂肪细胞的祖细胞，其成骨和成脂分化的失平衡，是骨形成和脂肪形成平衡紊乱的根本原因。BMSCs在向骨细胞及脂肪细胞分化之间存在着反向变化关系，这一结论对研究骨质疏松症发病机制至关重要。
　　研究发现miRNA参与BMSCs的分化调控，决定着干细胞的分化方向。本课题组前期研究发现miR-130b在BMSCs成骨分化中呈高表达趋势，在成脂分化过程中呈低表达趋势，这就提示miR-130b同时参与了成骨和成脂分化两个过程。但是，miR-130b在BMSCs成骨和成脂分化过程中具体作用是什么？miR-130b是否起着调控BMSCs成骨和成脂分化平衡的作用？这些目前尚不明确。因此，本研究在建立BMSCs成骨和成脂分化体系的基础上，拟通过上调miR-130b的表达水平，研究其对BMSCs成骨和成脂分化能力的影响，进一步阐明miR-130b在骨髓间充质干细胞成骨、成脂分化平衡的作用。
　　方法：(1)将人骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行人工复苏、传代培养，用流式细胞仪分析细胞表面标志物（CD29、CD44、CD90、CD105、CD34和CD45）。(2)对人骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行成骨、成脂诱导分化及细胞学鉴定。成骨分化培养体系：H-DMEM培养液（由10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、0.1μmol/L地塞米松、10％FBS、50μmol/L抗坏血酸磷酸盐配制）;成脂分化培养体系：H-DMEM培养液（含10％FBS、1μmol/L地塞米松、200μmol/L吲哚美辛、0.5mmol/L IBMX、10μg/ml胰岛素）。(3)分别构建表达miR-130b和NC的慢病毒载体，选择不同滴度病毒感染BMSCs细胞。(4)对上调miR-130b和NC表达水平后BMSCs进行成骨、成脂诱导分化及相关鉴定分析，检测其成骨、成脂分化能力的变化。
　　结果：(1)复苏传代的细胞通过流式细胞仪显示：CD29、CD44、CD90及CD105的表达阳性，CD34和CD45的表达阴性，与人骨髓间充质干细胞(BMSCs)特征相符。(2)经成骨诱导培养7天后倒置显微镜观察可见细胞逐渐汇合成铺路石状，随着时间延长，细胞开始堆积形成多个结节。经过碱性磷酸酶染色发现培养14天后出现褐色点状矿化结节中心，培养21天后形成小片状矿化结节。(3)经成脂诱导7天后倒置显微镜观察可见细胞从最初的长梭形向多角形或者圆形转变，经过油红染色发现细胞浆开始出现小脂滴、细胞无序，细胞内脂滴水平上升，细胞体积变大，诱导分化2周后可见大量的脂滴形成。(4)分别构建表达miR-130b和NC慢病毒载体，成功转染BMSCs细胞，建立过表达miR-130b的BMSCs细胞系和对照组细胞系。(5)上调miR-130b表达水平的BMSCs细胞与对照组细胞相比：经过成骨诱导分化培养后可见其成骨特性更强，碱性磷酸酶活性明显升高，Western Blot检测显示成骨相关基因RUNX2的表达较比对照组上调;经过成脂诱导分化培养后可见其成脂特性减弱，油红染色显示脂滴数目和脂肪细胞比例显著降低，Western Blot检测显示成脂相关基因CEBP Alpha的表达比对照组降低。
　　结论：(1)人骨髓间充质干细胞(BMSCs)经过复苏、传代培养后具有良好的生物活性，可以作为种子细胞。(2)人骨髓间充质干细胞(BMSCs)在不同诱导剂作用下能够分化为成骨细胞、脂肪细胞。(3)成功建立上调miR-130b表达水平的BMSCs细胞系。(4)上调miR-130b的表达水平可以促进BMSCs的成骨分化能力，而抑制成脂分化能力。

目录

声明

摘要

前言

实验一 人骨髓间充质干细胞的培养和特性观察

(一)材料和方法

1 材料

2 方法

(二)结果

1．人BMSCs传代培养细胞形态观察

2．人BMSCs细胞表面标志物的测定

(三)讨论

(四)结论

实验二 人骨髓间充质干细胞的成骨、成脂诱导分化

(一)材料和方法

1．材料

2．方法

(二)结果

2．诱导人BMSCs向成脂肪细胞分化结果

(三)讨论

(四)结论

实验三 建立上调miR-130b表达水平的BMSCs细胞系(一)

材料和方法

2．方法

(二)结果

不同滴度病毒感染后miR-130b的QPCR检查结果

(三)讨论

(四)结论

实验四 观察上调miR-130b表达水平后BMSCs成骨、成脂分化能力的变化

(一)材料和方法

2．方法

(二)结果

1 转染miR-130b对BMSCs成骨分化功能产生的影响

2 转染miRNA-130b对BMSCs细胞成脂分化功能产生的影响

(三)讨论

(四)结论

参考文献

综述 miRNA调控人骨髓间充质干细胞成骨和成脂分化作用研究

英文略语

攻读学位期间发表文章情况

致谢