Dectin-1受体表达与多种细胞因子的相关性在真菌性角膜炎中作用的实验探讨

摘要

真菌性角膜炎(Fungal keratitis，FK)是一类由真菌感染而引发机体角膜组织发生炎症反应性疾病。本病是由Leber于1878年首次报道，是一类常见的、较顽固的真菌感染。由于本病早期诊断及治疗困难，常导致患者角膜溃疡或穿孔，进展为眼内炎，引发视力障碍或失明。近年来，由于在临床上大量使用抗生素、皮质类激素、免疫抑制剂等药物，我国真菌性角膜炎在人群中发病率呈逐年增高趋势，以男性及农村居民感染为主，继白内障之后成为首要致盲性眼病[1]，给人们家庭及社会发展造成巨大的经济负担。镰刀菌和曲霉毒是引起眼部真菌感染的主要菌种，而曲霉菌引起的眼感染症中主要是由感染烟曲霉菌和黄曲霉菌所致。在一些地区真菌角膜感染已经成为主要的致病原[2]。目前，临床上真菌感染的患者很多，然而治疗真菌性角膜炎的有效药物却很少，并且治疗比较困难。因此，深入研究本病的病原学、病理学、免疫学、诊断学和流行病学，对本病的早期诊断和防治有着重要的意义。
　　角膜呈球冠型，中央薄，边缘厚，自外向内由5层角膜细胞和结缔组织所构成，其机械屏障可以抵御真菌的感染。角膜上皮细胞及基质细胞也可以通过表达一些模式识别受体(PRRs)，通过病原相关分子模式(PAMPs)激活人体的固有免疫，诱导特异的适应性免疫应答，以清除病原体[3]，修复病原对人体的损害。
　　Ariizumi等人于2000年首次发现树突状细胞相关C型凝集素-l(Dentritk cell associated C Type lectin-1，Dectin-1)[4]，后者是树突状细胞表面特异性表达的受体，并且广泛分布于树突状细胞、单核细胞、B细胞以及部分T细胞亚群等。同时，在鼠神经胶质细胞上亦有表达[5]。最近有研究表明，Dectin-1能够识别真菌、细菌表面的β-1、3/β-1、6-葡聚糖和碳水化合物。在真菌感染过程中，Dectin-1参与Th17细胞的产生，后者能够分泌产生IL-6、IL-17A、TNF-α和IL-17F等细胞因子，这些细胞因子可以动员、募集及活化中性粒细胞，对抗细胞外真菌及细菌感染的免疫反应。Th17细胞产生的IL-17能有效地介导中性粒细胞动员的兴奋过程，从而有效地诱导组织的炎症反应。由于Tyr238X突变使得Dectin-1不能在细胞膜上表达，减少了IL-17的产生，增加了真菌感染的易感性[6][7][8]。而IL-12和TNF-α因子在抗真菌感染反应中也发挥重要的作用。
　　Dectin-1受体是一类跨膜结构，属于C型凝集素受体家族中的一员，其能够识别外源性病原菌，例如真菌和分歧杆菌等，也能够识别T细胞表达的内源性配体。由于这一受体能够识别真菌，因此在真菌性角膜炎患者体内能够被发现。而在对患者实施临床诊断和治疗时，也可通过干预Dectin-1受体作用而达到良好的效果。但需注意的是，当前我国在对真菌性角膜炎患者的临床诊治研究中，对Dectin-1受体已有一些研究，但需要更深入的探讨，正是据此本文开展这方面的研究。
　　目的：
　　本文拟探讨真菌性角膜炎动物模型建立后大鼠角膜的病理变化，Dectin-1受体的表达水平，以及Dectin-1受体与IL-17、IL-12和TNF-α等多种细胞因子之间的关系，以期揭示Dectin-1受体在抗真菌性角膜炎免疫应答中的作用和机制，为临床上诊治真菌性角膜炎，寻找新的治疗靶点提供进一步的实验依据。
　　方法：
　　一、动物模型建立
　　1.实验动物与分组
　　选取由大连医科大学实验动物中心提供的60只Wistar清洁级、健康大鼠，雌雄不限、8周龄，体重在200g-250g之间，经裂隙灯显微镜检测后眼部角膜组织均没有结构和功能病变。将这些大鼠分为三组:实验组1、实验组2和对照组，每组分别为25只、25只和10只。
　　2.模型建立
　　(1)采用中国普通微生物菌种保藏管理中心提供的烟曲霉菌菌株(编号为3.0772)，制备成浓度为1×108个菌丝/毫升的菌悬液。
　　(2)分别测定实验大鼠的眼部角膜曲率半径，计算平均值作为最终值，将封口膜制备成相应曲率半径的角膜接触镜，并使用浓度为75％的乙醇进行浸泡消毒。
　　(3)实验组1的25只大鼠眼部给予Dectin-1特异性抑制剂昆布多糖(Laminarin)处理;实验组2的25只大鼠眼部给予生理盐水处理，不使用昆布多糖(Laminarin)。
　　(4)实验组1和实验组2的50只大鼠，均在角膜中部区域钻大约2mm的圆形印痕。
　　(5)将菌悬液滴在实验组1和实验组2大鼠的角膜上，用制备好的角膜接触镜进行覆盖，缝合眼睑，保证大鼠感染目标菌株，建立真菌性角膜炎大鼠动物模型。
　　二、实验方法
　　在建立真菌性角膜炎动物模型后，在第1天、第2天、第3天和第5天，分别取对照组、实验组1、实验组2的大鼠角膜上皮组织。
　　1.HE染色后进行病理学观察;
　　2.采用免疫组化法检测各组大鼠角膜组织中Dectin-1的表达量;
　　3.提取和收集RNA，采用QRT-PCR技术分别测定并比较各组大鼠Dectin-1、TNF-α、IL-17、IL-12的mRNA表达水平。
　　结果：
　　1.病理学结果
　　对照组大鼠的角膜完整、没有水肿和炎症细胞浸润现象;实验组1和实验组2大鼠角膜可见水肿增厚、溃疡处上皮缺失前弹力层、前房及基质中有较多中性粒细胞浸润。
　　2.免疫组化结果
　　对照组和实验组1的大鼠角膜组织中dectin-1受体的表达始终呈弱阳性;真菌感染1天后，实验组2的大鼠角膜组织中dectin-1受体的表达就开始呈现强阳性，一直持续到第5天。
　　3.QRT-PCR检测结果
　　(1)对照组、实验组1和实验组2大鼠角膜组织中都有Dectin-1、TNF-α、IL-12的表达。
　　(2)在对照组和实验组1大鼠角膜组织中均没有IL-17的表达。
　　(3)实验1天后，实验组2大鼠角膜组织细胞中Dectin-1的表达量比对照组和实验组1明显增加(P＜0.05)，实验组1大鼠角膜组织中Dectin-1的表达量与对照组之间无统计学差异（P＞0.05）。
　　(4)实验组1大鼠角膜组织中IL-12、TNF-α的表达量比对照组明显增加(P＜0.05)。
　　(5)实验组2大鼠角膜组织中IL-12的表达量在第1天到第3天持续增加，而TNF-α的表达量在第1天到第5天持续增加。
　　结论：
　　1.在真菌感染后，大鼠角膜组织中的Dectin-1表达量增加，Dectin-1的表达量可能和炎症反应的应答程度密切相关。
　　2.IL-17的合成可能依赖于Dectin-1受体介导的细胞内信号通路。
　　3.IL-12可能在真菌感染的早期发挥作用，Dectin-1受体参与炎症因子IL-12的表达，IL-12还受其他类型的细胞受体所诱导。
　　4.TNF-α因子参与真菌性角膜炎角膜组织炎症反应，且该因子的表达水平和Dectin-1受体没有显著的关系，其可能经细胞上的其他受体诱导的信号转导途径所调控。

目录

声明

摘要

(一)前言

(二)材料与方法

1．研究材料

1．1 实验动物

1．2 研究试剂和仪器

2．研究方法

2．1 分组方法

2．2 大鼠模型建立方法

2．3 组织石蜡切片方法

2．4 苏木素／伊红染色方法

2．6 QRT-PCR方法

3．结果判断

4．统计学方法

(三)结果

1．苏木素／伊红染色结果

2．免疫组化检测结果

3．QRT-PCR检测结果

(四)讨论

(五)结论

参考文献

综述 Dectin-1受体生物学活性与其抗真菌感染免疫的研究进展

致谢