gus基因线性片段花粉管通道法转化大豆的研究

摘要

花粉管通道法转化大豆避免了组织培养过程,操作简便经济,但由于缺少Southern blot及后代遗传学分析证明外源基因整合进植物染色体上,在大豆转基因育种方面受到了限制.该文将pBI121质粒通过花粉管途径导入大豆,经过PCR、RT-PCR、GUS组织化学染色、Southern杂交等检测分析,获得了2株大豆转基因植株;对其T<,2>代进行了PCR检测,获得了阳性植株,说明花粉管通道法转化大豆是能够实现遗传的.充分利用分子生物学证据证明了花粉管通道法转化大豆的可行性.最近的研究报道证明载体骨架序列整合进植物染色体上可能会影响植物正常基因的表达和促进转基因的重排等,已经成为转基因生物安全性的热点问题.该文将无载体骨架序列的gus基因线性转化元件通过花粉管途径转化大豆,经过PCR、RT-PCR、GUS组织化学染色、Southern杂交等检测分析,获得了8株阳性植株.对这8个株系的T<,2>代进行了PCR检测,在每个株系中均检测到阳性植株,对其2个株系的T,<2>代进行Southern-blot检测,获得了阳性杂交信号,说明外源基因在大豆基因组是可以稳定遗传的.充分证明了gus基因线性片段花粉管通道法转化大豆的可行性,验证了无载体骨架序列、无组织培养的转基因植物操作体系的可行性.实现多个外源基因共转化获得多性状的农作物已经成为植物育种的热点问题.该文构建了bar基因线性转化片段,将其和gus基因线性转化片段通过花粉管途径共转化大豆,为共转化研究奠定了基础.

目录

文摘

英文文摘

前言

1文献综述

1.1gus基因概述

1.1.1 gus基因来源

1.1.2 gus基因的酶学特性

1.1.3 GUS活性测定

1.2花粉管通道途径进行基因转化的研究进展

1.2.1花粉管通道法提出的依据

1.2.2花粉管通道法转化的机理

1.2.3利用花粉管通道途径转基因的技术评价

1.2.4花粉管通道法对大豆基因转化的优越性

1.2.5花粉管通道法在转基因大豆中的应用

1.3 T-DNA边界序列概述

1.4转基因植物中载体骨架序列的生物安全性研究

1.4.1载体骨架序列整合进植物染色体中

1.4.2载体骨架序列整合进植物染色体中可能存在的安全性隐患

1.4.3解决载体骨架序列的研究思路和方法

1.4.4基本元件转化植物的研究进展

1.5本课题的研究内容及意义

参考文献

2花粉管通道法转化大豆的可行性研究

2.1引言

2.2材料和方法

2.2.1实验材料

2.2.2实验方法

2.3结果与讨论

2.3.1花粉管介导大豆基因转化的适宜时间及措施

2.3.2转化豆荚的形态特征观察

2.3.3 T1代转化植株的PCR检测

2.3.4 T1代转化植株的RT-PCR检测

2.3.5 T1代GUS组织化学染色

2.3.6 T1代转化植株的Southern杂交

2.3.7 T1代转化植株结果统计

2.3.8 T2代转化植株检测及结果统计

2.4小结

参考文献

3 gus基因线性化片段花粉管通道转化大豆的研究

3.1引言

3.2材料和方法

3.2.1实验材料

3.2.2实验方法

3.3结果与讨论

3.3.1基因转化元件的制备

3.3.2结实数统计

3.3.3 T1代转化大豆的检测

3.3.4 T2代转化植株的检测

3.3.5 T3代转化大豆的检测结果

3.3.6花粉管通道法转化大豆整合模式的分析

3.4小结

参考文献

4共转化基因元件的构建

4.1引言

4.2实验材料

4.2.1主要仪器和试剂

4.2.2主要仪器和试剂

4.2.3引物的设计和合成

4.3实验方法

4.3.1酶切载体pZY102

4.3.2酶切目的产物的回收

4.3.3 pUC118载体的制备

4.3.4 pUC118载体与酶切目的片段的连接

4.3.5感受态细胞的制备

4.3.6转化

4.3.7 PCR检菌

4.3.8 DNA测序

4.3.9 bar基因的PCR扩增

4.3.10酶切bar基因片段和载体pUC11 8-gus

4.3.11 bar基因转化元件获得

4.3.12花粉管通道法共转化大豆

4.4结果与讨论

4.4.1 bar基因转化元件的构建

4.4.2 bar基因转化片段的获得

4.4.3花粉管通道共转化大豆

4.5小结

参考文献

5结论与展望

5.1主要结论

5.2创新点

5.3有待进一步开展的工作

硕士期间发表的论文

致谢

附录

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