盐析萃取偶联柱层析分离纯化血浆蛋白

摘要

血浆蛋白由数百种具有广泛生理功能的蛋白质组成，其中白蛋白与免疫球蛋白占据着血液制品中主要的市场份额。血浆成分十分复杂，目前工业上血浆蛋白的分离方法主要采用有机溶剂沉淀法、盐析法和柱层析，但这些方法尚存在着分离环境要求低温、分离纯化步骤繁琐、纯度和收率低等缺点。本论文开展了亲水性有机溶剂盐析萃取偶合柱层析分离纯化血浆蛋白的研究，以期为血浆蛋白的分离纯化提供新方法。
　　(1)首先考察了免疫球蛋白G(IgG)在亲水性有机溶剂盐析萃取中的分配规律，选取磷酸氢二钾、碳酸钠、柠檬酸钠三种盐分别与乙醇组成盐析萃取体系，考察了不同盐、醇含量对IgG在体系中分配的影响。结果表明，20％磷酸氢二钾(w/w)-14％乙醇(w/w)、19％碳酸钠(w/w)-13％乙醇(w/w)、25％柠檬酸钠(w/w)-19％乙醇(w/w)为三种盐析萃取体系的最佳组成，在这些条件下，IgG回收率分别为97.4％、93.1％、90.2％。采用ELISA法检测了磷酸氢二钾-乙醇、碳酸钠-乙醇两种体系萃取后IgG的活性，发现经磷酸氢二钾体系萃取后，IgG活性基本维持不变，而经碳酸钠体系萃取后，IgG活性损失率达70％以上。
　　(2)将20％磷酸氢二钾(w/w)-14％乙醇(w/w)盐析萃取体系调节pH至7.0后，直接从猪血浆中萃取IgG与白蛋白，盐析萃取能明显去除部分杂质蛋白，葡萄糖的去除率达51.82％。根据上相中富含盐的特点，选取疏水层析作为后续纯化手段，可得到较高纯度的白蛋白与IgG混合物，该混合物再经过阴离子交换层析后，可得到高纯度白蛋白和IgG，白蛋白和IgG样品经非还原SDS-PAGE分析均显现单一条带，光密度扫描显示纯度大于99％。
　　上述结果表明，亲水性有机溶剂盐析萃取偶联柱层析技术能够实现血浆蛋白的高效分离。和传统的盐析、冷乙醇法和柱层析法相比，具有操作条件温和，分相时间短，操作简便，易于放大，目标蛋白纯度高等优点，具有工业化应用的前景。

目录

声明

摘要

引言

1 文献综述-血浆蛋白及其分离纯化方法的研究进展

1．1 血液与血浆蛋白中的功能蛋白

1．1．1 白蛋白

1．1．2 免疫球蛋白

1．1．3 凝血因子

1．1．4 血浆蛋白制品的来源与市场

1．2 免疫球蛋白、白蛋白和凝血因子的分离纯化方法

1．2．1 粗分离

1．2．2 纯化

1．2．3 现有技术存在的问题

1．3 双水相萃取与盐析萃取

1．3．1 双水相萃取的特点

1．3．2 双水相萃取的应用

1．3．3 亲水性有机溶剂盐析萃取技术

1．4 本课题的研究内容与意义

1．4．1 本课题的研究内容

1．4．2 本课题的研究意义

2 IgG在亲水性有机溶剂／盐盐析萃取体系中的分配规律

2．1 引言

2．2 实验材料与仪器

2．2．1 实验试剂

2．2．2 实验仪器

2．3 实验方法

2．3．1 乙醇／盐盐析萃取体系相图的绘制

2．3．2 免疫球蛋白G在盐析萃取体系中分配行为的研究

2．3．3 分析方法

2．4 结果与讨论

2．4．1 Bradford法标准曲线的测定

2．4．2 HPLC检测方法的建立

2．4．3 乙醇／盐盐析萃取体系相图的绘制

2．4．4 不同浓度乙醇、盐用量对IgG回收率的影响

2．4．5 萃取时间对IgG回收率的影响

2．4．6 pH对IgG回收率的影响

2．4．7 NaCl的添加量对IgG回收率的影响

2．5 本章小结

3 盐析萃取后IgG的分析

3．1 引言

3．2 实验试剂与仪器

3．2．1 实验试剂

3．2．2 实验仪器

3．3 结构与活性检测

3．3．1 还原SDS-PAGE与非还原SDS-PAGE电泳分析

3．3．2 直接酶联免疫法检测活性

3．3．3 IgG结构检测

3．4 结果与讨论

3．4．1 SDS-PAGE电泳检测

3．4．2 直接酶联免疫

3．4．3 IgG结构检测

3．5 小结

4 盐析萃取偶联柱层析分离纯化猪血的血浆蛋白

4．1 引言

4．2 实验试剂与仪器

4．2．1 实验试剂

4．2．2 实验仪器

4．3 实验方法

4．3．1 猪血浆的制备

4．3．2 乙醇／K2HPO4体系萃取分离血液中的IgG

4．3．3 乙醇／K2HPO4体系萃取对血液中的血糖的去除效果

4．3．4 疏水层析纯化乙醇／KEHPO4体系萃取的血浆样品

4．3．5 阴离子交换层析

4．4 实验结果

4．4．1 盐析萃取分离猪的血浆蛋白

4．4．2 疏水层析

4．4．4 阴离子交换层析

4．5 本章小结

结论

展望

参考文献

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢