柞蚕新型转基因载体构建和精子介导转化研究

摘要

柞蚕是我国特有的一种野外饲养的经济昆虫。相比于家蚕，柞蚕由于其种群和生长环境的特殊性使其在抗病害能力、耐气候变化能力等方面具有显著的优势，是不可替代的重要生物资源。因此，开展柞蚕转基因研究，对于了解柞蚕重要基因功能，通过转基因柞蚕育种技术改善柞蚕丝品质，提升柞蚕市场竞争，以及利用柞蚕作为生物反应器，开发柞蚕资源的新用途等都具有十分重要的意义。
　　本文在前期研究的基础上，对柞蚕转基因载体进行了改造，优化了启动子、转座子和报告基因等重要的转基因元件，构建了新型的柞蚕双元转基因载体;利用荧光标记技术对精子介导途径进行了观察;克隆了人工拼接的蜘蛛拖牵丝基因片段，利用精子介导途径对柞蚕进行转基因研究，获得了报告基因整合和表达的初步证据。主要研究内容和结论如下:
　　(1)通过染色体步移的方法扩增得到了全长为1927bp的柞蚕肌动蛋白Al启动子，其与家蚕肌动蛋白启动子核心区域同源率为92％，具有典型的真核生物启动子特征。通过对启动子功能区域的删除研究，确定了启动子的表达调控区域。发现Al启动子的F4片段具有较强的正向调控功能，可在转基因研究中作为强启动子调控柞蚕基因的表达，在TATA box上游可能存在抑制元件，对基因表达起到负向调节的作用。
　　(2)利用Tail-PCR方法加长柞蚕丝素基因5'和3'端序列，并与GFP标记基因融合，构建了新的丝素基因同源表达框Fib-GFP。将上述表达框与Al驱动的红色荧光蛋白基因一同插入到piggyBac转座子两个重复序列之间，得到柞蚕基因转移载体pBac[Al-DsRed+Fib-GFP];利用柞蚕肌动蛋白Al启动子改造辅助转移载体，得到辅助载体pBacAlHelper。将Al-piggyBac表达框插入到包含反向重复序列的转移载体上，构建柞蚕双元基因转移载体pBac[Al-DsRed+Fib-GFP]-Al-piggyBac。通过对Sf9细胞进行转染实验，证明两种转移系统都能够正常工作，而且整合效率比较表明双元表达载体比转移载体与辅助质粒的双质粒载体系统具有更高的整合效率，具有在柞蚕个体转基因研究中应用的潜力。
　　(3)利用FITC示踪技术研究了柞蚕精子与DNA吸附及转移途径，并建立柞蚕的精子介导转基因体系。将柞蚕精液与FITC标记的外源DNA混合后，荧光显微镜下检测到精子头部有荧光现象，表明柞蚕精子具有摄取外源DNA的能力。将FITC标记的外源DNA导入柞蚕雌蛾体内，在荧光显微镜下观察外源DNA进入雌性生殖系统的运动过程，证实了昆虫通过精子介导实现转基因的途径。利用精子介导将携带GFP基因的载体导入蚕卵，在蚕卵中观察到瞬时表达的绿色荧光，通过RT-PCR和Western blot检测结果证明绿色荧光蛋白基因可经精子介导实现转移和表达。
　　(4)利用巢式PCR技术从大腹圆蛛Araneus ventricosus基因组中克隆了长度为837bp的蜘蛛拖牵丝蛋白基因(ASP)。将得到的拖牵丝蛋白基因(ASP)分别构建至原核表达载体pGEX-6p-1和真核表达载体pGFP-N2上，成功实现了ASP基因在大肠杆菌和真核细胞中的表达。
　　(5)将蜘蛛拖牵丝蛋白基因(ASP)克隆至柞蚕双元基因转移载体上，利用精子介导法进行柞蚕转基因实验，经过分子鉴定，证明蛛丝与GFP融合基因在柞蚕丝腺中得到表达。

目录

声明

摘要

图表目录

引言

1 柞蚕转基因研究进展

1．1 柞蚕

1．1．1 柞蚕概况

1．1．2 柞蚕的转基因研究进展

1．2 昆虫转基因元件

1．2．1 启动子

1．2．2 转座子

1．2．3 报告基因

1．3 昆虫转基因方法

1．3．1 显微注射法

1．3．2 基因枪法

1．3．3 电穿孔法

1．3．4 精子介导法

1．3．5 其他方法

1．4 精子介导转基因途径

1．4．1 动物精子介导的转基因

1．4．2 昆虫精子介导的转基因

1．4．3 精子介导途径的机理研究

1．5 本文主要研究目的与内容

1．5．1 研究目的

1．5．2 研究内容

1．5．3 技术路线

2 柞蚕肌动蛋白A1基因启动子的克隆与分析

2．1 引言

2．2 材料与设备

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验试剂

2．2．3 实验设备

2．3 实验方法

2．3．1 柞蚕肌动蛋白A1基因启动子片段的克隆

2．3．2 启动子的结构分析

2．3．3 启动子的功能分析

2．4 实验结果

2．4．1 柞蚕肌动蛋白A1启动子片段

2．4．2 启动子区域的结构分析

2．4．3 启动子区域的功能分析

2．5 讨论

2．6 小结

3 柞蚕新型基因转移载体的构建与验证研究

3．1 引言

3．2 材料与设备

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验试剂

3．2．3 实验设备

3．3 实验方法

3．3．1 柞蚕转移载体与辅助质粒的构建

3．3．2 柞蚕双元基因转移载体的构建

3．3．3 柞蚕转移载体在Sf9细胞中的转化实验

3．4 实验结果

3．4．1 柞蚕基因转移载体和辅助载体系统

3．4．2 柞蚕双元基因转移载体

3．4．3 柞蚕两种基因转移载体在Sf9细胞中的表达

3．5 讨论

3．6 小结

4 柞蚕精子介导转基因途径观察

4．1 引言

4．2 材料与设备

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验试剂

4．2．3 实验设备

4．3 实验方法

4．3．1 雌蛾解剖与生殖器官观察

4．3．2 FITC标记外源DNA及在雌蛾生殖系统中的运动轨迹观察

4．3．3 GFP基因导入蚕卵的观察与分子鉴定

4．4 实验结果

4．4．1 雌蛾的生殖系统

4．4．2 FITC标记的外源DNA与精子的体外结合

4．4．3 FITC标记的外源DNA进入雌蛾生殖器官的途径

4．4．4 蚕卵的GFP荧光

4．4．5 分子鉴定

4．5 讨论

4．6 小结

5 蛛丝蛋白基因的克隆与转蛛丝蛋白基因柞蚕的初步研究

5．1 引言

5．2 材料与设备

5．2．1 实验材料

5．2．2 实验试剂

5．2．3 实验设备

5．3 实验方法

5．3．1 蜘蛛丝蛋白基因的克隆

5．3．2 蛛丝蛋白基因在大肠杆菌中的表达

5．3．3 蛛丝蛋白基因在昆虫细胞中的表达

5．3．4 蛛丝蛋白基因转移载体的构建

5．3．5 柞蚕转基因条件的优化

5．3．6 转基因柞蚕的鉴定

5．4 实验结果

5．4．1 蜘蛛拖牵丝蛋白基因片段的克隆

5．4．2 蛛丝蛋白基因的体外表达

5．4．3 含蛛丝蛋白基因的双元基因转移载体

5．4．4 精子介导转基因条件的优化结果

5．4．5 转蛛丝蛋白基因柞蚕的检测鉴定

5．5 讨论

5．6 小结

6 结论与展望

6．1 结论

6．2 创新点摘要

6．3 有待进一步开展的工作

6．4 展望

参考文献

附录A 缩略词

作者简介

攻读博士学位期间科研项目及科研成果

致谢