柞蚕核型多角体病毒细胞凋亡蛋白抑制因子的表达及其功能分析

摘要

细胞凋亡是昆虫宿主细胞抗病毒感染及控制病毒复制增殖的一个重要分子机制。杆状病毒细胞凋亡蛋白抑制因子(IAP)在调节细胞凋亡的过程中起着重要的作用，但其作用的靶分子蛋白及机理仍不清楚。柞蚕是我国特有的经济昆虫，受到柞蚕核型多角体病毒(ApMNPV)的危害，其产量和质量受到直接影响。ApMNPV基因组编码两个可能的细胞凋亡蛋白抑制因子(Ap-IAP1和Ap-IAP2)，我们对它们的性质、功能及在柞蚕抗病毒防御机制上的作用不了解。
　　本文通过基因表达分析、体外蛋白质相互作用、体内基因干扰等方法分析这两个蛋白质在抑制细胞凋亡过程中的作用。实验结果表明:(1)分析了Ap-iap1和iap2基因5'端和3'端非编码区序列;ApMNPV△ph/egfp+能够感染TnHi-5细胞，能够表达EGFP蛋白;Ap-iap1和Ap-iap2基因在病毒感染早期即有转录表达，但转录表达水平低于DNA pol基因。(2)体外表达的Ap-IAP1和Ap-IAP2都具有蛋白质结合能力，Ap-IAP1既能够自身结合，也可以与Ap-IAP2结合。(3) ApMNPV感染Tn-Hi5细胞后可抑制放线菌素D诱导的细胞类caspase-3蛋白酶活性;RNAi方法证实干扰Ap-iap1基因表达能降低ApMNPV抑制细胞凋亡的作用，同时降低Ap-iap2和DNApol基因转录表达，干扰Ap-iap2基因表达也能降低Ap-iap1和DNA pol基因的转录表达。根据上述结果，我们认为Ap-IAP1在ApMNPV抑制细胞凋亡中起作用，Ap-IAP2参与ApMNPV抑制细胞凋亡。Ap-IAP1和Ap-IAP2功能不同，但它们有一定的关联性，并共同影响DNA pol基因表达。本文系统地分析了Ap-IAP1和Ap-IAP2的特性及在抑制细胞凋亡中的作用，同时发现它们在病毒感染复制中的作用，并为进一步分析其作用对象提供了线索。为今后深入研究柞蚕抗病毒机制，开展柞蚕抗病育种提供了依据。

目录

声明

摘要

引言

1 文献综述

1．1 细胞凋亡概念

1．2 细胞凋亡特征

1．2．1 形态学变化

1．2．2 生物化学变化

1．3 昆虫杆状病毒侵染与昆虫抗病毒防御

1．3．1 杆状病毒特点与侵染过程

1．3．2 昆虫抗病毒防御

1．4 杆状病毒细胞凋亡抑制蛋白

1．5 柞蚕核型多角体病毒细胞凋亡蛋白抑制因子

1．5．1 柞蚕

1．5．2 柞蚕核型多角体病毒

1．5．3 柞蚕核型多角体病毒基因组

1．5．4 柞蚕核型多角体病毒细胞凋亡蛋白抑制因子

1．6 本研究的目的

2 ApMNPV细胞凋亡蛋白抑制因子Ap-iap1和iap2基因分析

2．1 引言

2．2 实验材料、试剂与仪器

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验试剂

2．2．3 实验仪器

2．3 实验方法

2．3．1 细胞培养及病毒感染

2．3．2 细胞转染

2．3．3 ApMNPV△ph／egfp+病毒感染Tn-Hi5细胞的总RNA提取

2．3．4 qRT-PCR检测

2．3．5 Ap-iap1和iap2基因的5’RACE

2．3．6 Ap-iap1和iap2基因的3’RACE

2．3．7 目的片段克隆及测序

2．4 结果与分析

2．4．1 ApMNPV对Tn-Hi5细胞的感染性

2．4．2 Ap-iap1和iap2基因5’端和3’端非编码区扩增及克隆

2．4．3 Ap-iap1和iap2基因5’端和3’端非编码区序列分析

2．4．4 qRT-PCR分析Ap-iaps基因转录表达

2．5 讨论

2．6 小结

3 Ap-iap1和／iap2基因原核表达载体的构建及表达研究

3．1 引言

3．2 实验材料、试剂与仪器

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验试剂

3．2．3 实验仪器

3．3 实验方法

3．3．1 Ap-iap1和iap2基因序列的克隆

3．3．2 原核表达载体的构建

3．3．3 目的基因的表达

3．3．4 蛋白SDS-PAGE鉴定

3．4 结果与分析

3．4．1 Ap-iap1和iap2基因片段原核表达载体构建

3．4．2 Ap-iap1和iap2基因片段的克隆

3．4．3 原核表达载体重组质粒的双酶切鉴定

3．4．4 Ap-IAP1和IAP2在大肠杆菌中的表达分析

3．5 讨论

3．6 小结

4 Ap-IAP1和IAP2蛋白的抗体制备及性质分析

4．1 引言

4．2 实验材料、试剂与仪器

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验试剂

4．2．3 实验仪器

4．3 实验方法

4．3．1 融合蛋白的纯化

4．3．2 Western Blot鉴定

4．3．3 Bradford法测定蛋白含量

4．3．4 多克隆抗体的制备

4．3．5 E3泛素连接酶活性分析

4．3．6 蛋白质体外相互作用检测

4．4 结果与分析

4．4．1 Western Blot检测

4．4．2 E3泛素连接酶活性体外检测

4．4．3 相互作用蛋白质体外检测

4．5 讨论

4．6 小结

5 ApMNPV细胞凋亡蛋白抑制因子Ap-iap1和iap2抗细胞凋亡作用分析

5．1 引言

5．2 实验材料、试剂与仪器

5．2．1 实验材料

5．2．2 实验试剂

5．2．3 实验仪器

5．3 实验方法

5．3．1 Tn-Hi5细胞类caspase-3蛋白酶活性分析

5．3．2 双链RNA合成

5．3．3 RNAi

5．4 结果与分析

5．4．1 ApMNPV对抗Tn-Hi5细胞凋亡的作用

5．4．2 qRT-PCR分析RNAi对Ap-iaps及DNA pol基因转录表达的影响

5．4．3 Ap-iaps基因干扰对ApMNPV抑制细胞凋亡的影响

5．5 讨论

5．6 小结

结论

展望

参考文献

附录

致谢