代表性内分泌干扰物致小鼠性别发育和性别稳定异常的作用机制

摘要

内分泌干扰物(Endocrine disrupting chemicals，EDCs)广泛存在于空气、土壤、水体等环境介质中，能够干扰动物性别发育过程及性别稳定维持从而造成生物种群的性别比例失衡、生物个体性早熟、性反转等性别发育异常现象。最近研究发现在哺乳动物的性别发育过程中，除性染色体上的关键基因，位于常染色体上一系列转录因子和信号分子的调控对双潜能性腺的分化具有关键作用，性成熟后诸多性别决定基因也参与维系性腺的正常功能和性别稳定过程。因此，基于常染色体上的性别决定基因研究EDCs对哺乳动物性别发育过程和性别稳定维持的基因调控通路的影响，对阐明其生殖和发育毒性机理具有重要意义。本论文以抗雌激素效应化合物他莫昔芬(Tamoxifen，TAM)为模型化学物，研究其对小鼠性别发育和性别稳定维持过程常染色体上关键调控基因的影响，并基于这一研究结果进一步选择两种典型环境内分泌干扰物—双酚A(Bisphenol A，BPA)和三丁基锡(Tributyltin，TBT)，探讨其干扰小鼠性别发育过程的分子调控机理。本论文的主要研究内容和结果如下: 1.胚胎期暴露TAM对小鼠性别决定基因的影响。ICR孕鼠在妊娠第10.5天(dayspost-coitum，dpc)腹腔注射1 mg/kg·bw TAM，13.5 dpc取胎鼠生殖嵴，采用实时反转录多聚酶链式反应(Realtime reverse transcription polymerase chain reaction，Realtime RT-PCR)、整胚原位杂交对性别决定基因表达进行检测。结果发现性别决定关键期暴露TAM能够诱导雌性生殖嵴中血小板源生长因子受体吨(Platelet-derived growth factor receptor-α，Pdgfrα)过表达且表达模式与雄性生殖嵴类似，表明TAM能够诱导睾丸特异性体腔血管生成。同时TAM显著上调小鼠雌性生殖嵴中睾丸特异性转录因子Sry相关基因9(SRY-related HMG box gene9，Sox9)表达，但下调卵巢决定关键因子—叉头状转录因子基因2(Forkhead/winged helix transcription factor gene2，Foxl2)表达。SOX9和FOXL2蛋白表达水平的变化和基因表达变化一致。小鼠胚胎生殖嵴体外培养实验进一步证实TAM能够显著上调雌性生殖嵴中Pdgfrα和成纤维细胞生长因子9(Fibroblast growthfactor-9，Fgf9)表达，并降低雄性生殖嵴中Fgf9的表达。雌二醇和睾酮的比值（E2/T)在TAM暴露组中也显著降低。结果提示TAM抑制小鼠雌性生殖嵴常染色体上雌性特异性关键基因表达，激活雄性决定基因的表达，干扰性别发育过程，从而异常起始雌性生殖嵴中睾丸发育调控通路。 2.性成熟期TAM暴露对雌性小鼠性别稳定调控通路关键基因的影响。向性成熟的ICR雌性小鼠，连续7d分别腹腔注射75或225 mg/kg·bw TAM。暴露结束5d后，收集小鼠血清和卵巢，采用Realtime RT-PCR、免疫组织化学、蛋白免疫印迹(Western blot)对性别决定基因和蛋白的表达和分布进行检测。结果发现TAM上调了卵巢中睾丸索成分血小板内皮细胞粘附分子-1(Platelet/endothelial cell adhesion molecule1，PECAM-1)表达，表明TAM诱导卵巢产生睾丸特异性血管内皮细胞。此外，TAM还能够上调Sox9和Fgf9基因表达;抑制Foxl2、无翼乳房肿瘤病毒相关整合位点4(Wingless-related MMTV integrationsite4，Wnt4)和其下游基因卵泡抑制素(Follistatin，Fst)的表达。TAM暴露导致激素水平紊乱，雌二醇、孕酮、促卵泡生成素和黄体生成素水平降低，而睾酮含量增加。结果表明性成熟期TAM暴露可以抑制卵巢维持因子Foxl2和Wnt及其下游基因的表达，而激活睾丸决定因子Sox9和Fgf9，启动Sox9和Fgf9之间的反馈调节通路，从而干扰性成熟雌性小鼠卵巢功能维持和性别稳定。 3.胚胎期和哺乳期暴露BPA对雄性仔鼠性别发育调控通路关键基因的影响。ICR小鼠孕鼠从0.5 dpc直至出生后21 d(Postnatal day，PND21)连续暴露0.1 mg/kg·bw BPA。取PND0、7、28、49雄性仔鼠，收集血清及睾丸组织。采用Realtime RT-PCR、Western blot和免疫组织化学等方法对参与性别发育过程的关键基因和蛋白进行检测。结果发现，BPA未显著影响雄性仔鼠性成熟期FGF9及SOX9蛋白的表达，但抑制出生早期和性成熟期抗缪勒氏管激素(Anti-Mullerian hormone，Amh)、Sox9和Fgf9表达。同时BPA暴露下调了雄性仔鼠各时期锌指转录因子GATA结合蛋白4(Zinc finger transcription factorGATA-binding protein4，Gata4)的表达，使其在青春期未正常表达上调。此外，BPA诱导Foxl2、Wnt4、Fst和X染色体DSS-AHC决定区基因1(DSS-AHC critical region on the Xchromosome gene1，Dax1)表达上调。结果提示发育早期BPA暴露可抑制雄性仔鼠睾丸调控通路，激活卵巢调控通路，揭示了BPA诱导雄性动物雌性化的潜在机制。 4.胚胎期和哺乳期暴露TBT对雄性仔鼠性别发育调控通路关键基因的影响。ICR小鼠孕鼠从0.5 dpc直至PND21连续暴露20μg/kg·bw TBT。仔鼠出生后，在PND0、7、28、49取雄性小鼠血清及睾丸组织。采用Realtime RT-PCR、Western blot和免疫组织化学等方法对参与性别发育的关键基因和蛋白进行检测。结果发现胚胎期暴露TBT能够增加成年雄性仔鼠血清中E2/T，而对雌性仔鼠血清中E2/T无影响。TBT显著抑制PND0时Sox9、Fgf9和Amh基因表达水平，随时间延长无显著影响。TBT改变了生精细胞与精子形成相关基因Gata4的表达趋势，导致其表达异常升高并诱导其过早表达。TBT暴露未显著改变雄性仔鼠睾丸中卵巢发育特异性基因Foxl2等表达水平和时间规律。结果表明胚胎期和哺乳期暴露TBT干扰子代雄性性别发育过程，至成年期性激素分泌仍呈紊乱状态。 本论文研究了EDCs中三种代表性化学物对小鼠常染色体上性别决定基因的影响，发现基因调控通路的紊乱和其造成的性别发育和性别稳定异常一致，揭示了EDCs新的生殖发育毒性作用的潜在机制。该结果有助于阐明环境内分泌干扰物暴露与哺乳动物及人类的性别比例异常和生殖障碍之间的关联，同时有助于揭示发育早期接触EDCs对机体功能发育及后期健康的长期影响机制，为EDCs的健康风险评价提供科学依据。

目录

声明

摘要

主要缩写表

1 绪论

1．1 全球性的内分泌干扰物(EDCs)问题

1．1．1 环境中EDCs的来源及种类

1．1．2 EDCs的暴露途径

1．1．3 EDCs的毒性作用特点

1．1．4 EDCs的毒性效应

1．2 哺乳动物性别发育及性别稳定性维持的分子机制

1．2．1 胚胎性腺发生

1．2．2 性别发育过程基因表达和调控

1．2．3 哺乳动物性别决定的分子模型

1．2．4 哺乳动物性别稳定及性反转

1．3 EDCs对性别发育和性别稳定的影响

1．4 本文选题依据、研究内容和意义

1．4．1 选题依据

1．4．2 研究内容

1．4．3 研究意义

2 胚胎期暴露他莫昔芬对小鼠性别发育基因调控通路的影响

2．1 材料与方法

2．1．1 主要试剂

2．1．2 主要仪器设备

2．1．3 实验动物和染毒方式

2．1．4 胚胎生殖嵴收集

2．1．5 整胚原位杂交法检测生殖嵴中Pdgfrα的表达

2．1．6 Realtime RT-PCR检测胚胎生殖嵴中性别决定基因表达

2．1．7 免疫组化方法检测SOX9、AMH及FOXL2蛋白的表达

2．1．8 数据分析

2．2 结果与讨论

2．2．1 TAM对生殖嵴形态的影响

2．2．2 TAM对雌性生殖嵴中Pdgfrα表达的影响

2．2．3 TAM对雌性生殖嵴中Sox9和Amh表达的影响

2．2．4 TAM对雌性生殖嵴中Foxl2表达的影响

2．3 小结

3 TAM对体外培养胚胎生殖嵴性别发育基因调控通路的影响

3．1 材料与方法

3．1．1 主要试剂

3．1．2 主要设备仪器

3．1．3 实验动物

3．1．4 生殖嵴体外培养

3．1．5 培养基中雌二醇、孕酮及睾酮水平测定

3．1．6 胚胎生殖嵴中Pdgfrα、Fgf9和Jag1基因的表达

3．1．7 数据分析

3．2 结果与讨论

3．2．1 建立小鼠胚胎生殖嵴体外培养体系

3．2．2 体外TAM暴露对生殖嵴性激素分泌的影响

3．2．3 体外TAM暴露对生殖嵴中Pdgfrα、Jag1和Fgf9表达的影响

3．3 小结

4 性成熟期暴露TAM对小鼠性别稳定基因调控通路的影响

4．1 材料与方法

4．1．1 主要试剂

4．1．2 主要设备仪器

4．1．3 实验动物及染毒方式

4．1．4 卵巢形态学分析

4．1．5 血清中性激素测定

4．1．6 卵巢中性别稳定相关调控基因的表达

4．1．7 免疫组化检测卵巢中蛋白分布

4．1．8 Western blot检测蛋白表达

4．1．9 数据分析

4．2 结果与讨论

4．2．1 TAM对小鼠基本生物学指标及卵巢形态的影响

4．2．2 TAM对小鼠血清性激素水平的影响

4．2．3 TAM对卵巢中PECAM-1表达的影响

4．2．4 TAM暴露对卵巢中Sox9和Fgf9表达的影响

4．2．5 TAM对卵巢中凡Foxl2、Amh、Wnt4和Dax1表达的影响

4．3 小结

5 胚胎期和哺乳期暴露双酚A对雄性仔鼠性别发育基因调控通路的影响

5．1 材料与方法

5．1．1 主要试剂

5．1．2 主要设备仪器

5．1．3 实验动物及染毒方式

5．1．4 睾丸形态学分析

5．1．5 Realtime RT-PCR检测性别决定基因的表达

5．1．6 Western blot检测蛋白表达

5．1．7 数据分析

5．2 结果与讨论

5．2．1 BPA对仔鼠与母鼠基本生物学指标的影响

5．2．2 BPA对雄性仔鼠睾丸性别发育调控基因和蛋白表达的影响

5．3 小结

6 胚胎期和哺乳期暴露三丁基锡对雄性仔鼠性别发育基因调控通路的影响

6．1 材料与方法

6．1．1 主要试剂

6．1．2 主要设备仪器

6．1．3 实验动物及染毒方式

6．1．4 血清中性激素测定

6．1．5 Realtime RT-PCR检测性别决定基因的表达

6．1．6 数据分析

6．2 结果与讨论

6．2．1 TBT对仔鼠与母鼠的基本生物学指标的影响

6．2．2 TBT对成年雌、雄仔鼠血清中性激素水平的影响

6．2．3 TBT对雄性仔鼠睾丸中性别决定基因调控通路的影响

6．3 小结

7 结论与展望

7．1 结论

7．2 创新点

7．3 展望

参考文献

附录：主要试剂配制

作者简介

攻读博士学位期间科研项目及科研成果

致谢