迟缓爱德华氏菌特异性卵黄抗体对大菱鲆的被动保护研究

摘要

大菱鲆（Scophthalmus maximus）是世界范围内公认的优良经济鱼种之一，近年来其集约化养殖导致病害频发，经济损失严重，其中迟缓爱德华氏菌是威胁大菱鲆养殖业的首要病原菌。常见抗生素防治已导致菌株产生耐药性，且药物残留问题威胁食品安全和人类健康。卵黄抗体因具有特异性高、无耐药性、符合动物权益保护等优点，被视为一种重要的绿色安全抗生素替代品，其作为控制水生动物细菌性传染疾病的有效手段也越来越受到人们关注。
　　本研究以分离自患病大菱鲆的迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)制备灭活菌苗，免疫蛋鸡，经水稀释-冻融-二次盐析-超滤浓缩-冷冻干燥后获得卵黄抗体(IgY)提纯粉，测定其纯度为83.9％，ELISA测定抗体效价高达1∶25000;间接ELISA法检测特异性IgY对同种其他迟缓爱德华氏菌分离株同样具有高效结合活性。
　　特异性IgY对迟缓爱德华氏菌的体外抑菌结果显示，10 mg/mL特异性IgY能显著抑制迟缓爱德华氏菌在液体培养基中的生长;免疫荧光及透射电镜显示，特异性IgY能够与病原菌表面有效结合，使菌体凝集;扫描电镜进一步观察到IgY处理组迟缓爱德华氏菌菌体发生形变，菌体表面黏连且粗糙不平。特异性IgY能够显著降低对菌体表面疏水性及生物被膜形成能力(P＜0.05)，影响菌体的黏附力;菌体与IgY的反应液中碱性磷酸酶含量显著增高(P＜0.05)，推测其细胞壁完整性遭到破坏。
　　动物试验表明，大菱鲆经口服灌胃不同剂量特异性卵黄抗体后，死亡率均有降低，其中200 mg/kg（卵黄抗体量/鱼体重）剂量组治疗效果最佳，死亡率仅为12.5％，与对照组相比降低了69％;同时大菱鲆主要器官载菌量实验也显示，特异性IgY处理组大菱鲆肝脏、脾脏、头肾、肠道内的细菌数量与对照组相比显著降低。将卵黄抗体提纯粉及卵黄粉分别添加入饲料中，均对攻毒大菱鲆起到不同程度的保护作用，2％特异性IgY组存活率为75％，10％特异性卵黄粉试验组大菱鲆存活率为62.5％。
　　IgY对大菱鲆非特异性免疫相关免疫细胞和免疫因子的影响显示，特异性IgY能够增强大菱鲆头肾巨噬细胞的吞噬活性(P＜0.05)，激发和促进大菱鲆的非特异性免疫相关酶（溶菌酶、超氧化物歧化酶、碱性磷酸酶）的产生或活性。
　　综上所述，本研究制备的抗迟缓爱德华氏菌特异性卵黄抗体对大菱鲆具有被动保护作用，卵黄抗体作为安全高效的抗生素替代品具有良好应用前景。

目录

声明

摘要

引言

1 文献综述

1．1 大菱鲆迟缓爱德华氏菌病研究进展

1．1．1 大菱鲆简介

1．1．2 迟缓爱德华氏菌生物学特征

1．1．3 流行病学研究

1．1．4 迟缓爱德华氏菌致病机理

1．1．5 爱德华氏菌病的预防和治疗

1．2 卵黄抗体研究进展

1．2．1 IgY的结构与特点

1．2．2 IgY的理化特性

1．2．3 IgY的作用机理

1．2．4 IgY在水生和陆生动物饲料及疾病防治中的应用

1．3 本论文的研究目的及主要内容

2 抗迟缓爱德华氏菌特异性IgY的制备

2．1 前言

2．2 实验材料及设备

2．2．1 实验动物

2．2．2 实验病原菌

2．2．3 实验试剂

2．2．4 实验仪器

2．2．5 溶液配制

2．3 实验方法

2．3．1 迟缓爱德华氏菌的鉴定

2．3．2 迟缓爱德华氏菌的培养及生长曲线测定

2．3．3 免疫原的制备

2．3．4 蛋鸡的免疫

2．3．5 水溶性组分的提取

2．3．6 酶联免疫吸附实验(ELISA)检测特异性IgY抗体效价

2．3．7 IgY的分离与纯化

2．3．8 BCA法测定蛋白质含量

2．3．9 SDS-PAGE检测抗体纯度

2．3．10 特异性IgY与同属其他迟缓爱德华氏菌株的结合活性

2．4 结果与分析

2．4．1 迟缓爱德华氏菌16S rRNA鉴定及系统发育分析

2．4．2 抗原最佳包被浓度及抗体稀释倍数的确定

2．4．3 抗迟缓爱德华氏菌特异性IgY效价变化趋势

2．4．4 BCA法测定蛋白质含量

2．4．5 SDS-PAGE检测抗体纯化程度

2．4．6 特异性IgY与其它分离迟缓爱德华氏菌株的结合活性

2．5 讨论

2．6 小结

3 特异性卵黄抗体对迟缓爱德华氏菌的体外抑菌作用研究

3．1 前言

3．2 实验材料及设备

3．2．1 实验菌种

3．2．2 实验试剂

3．2．3 实验仪器

3．3 实验方法

3．2．1 IgY对病原菌的体外抑菌生长试验

3．2．2 免疫荧光与透射电镜

3．2．3 扫描电镜观察特异性IgY对菌体的作用

3．2．4 IgY对病原菌生物被膜形成的影响

3．2．5 IgY对病原菌疏水性的影响

3．2．6 IgY对病原菌菌体细胞壁完整性的影响

3．2．7 统计学分析

3．4 结果与分析

3．4．1 IgY对病原菌的体外生长抑制

3．4．2 免疫荧光与透射电镜

3．4．3 扫描电镜观察特异性IgY对菌体表面的作用

3．4．4 IgY对病原菌生物被膜形成的影响

3．4．5 IgY对病原菌疏水性的影响

3．4．6 IgY对病原菌细胞壁完整性的影响

3．5 讨论

3．6 小结

4 卵黄抗体对攻毒大菱鲆的被动保护效果研究

4．1 前言

4．2 实验材料及设备

4．2．1 试剂

4．2．2 仪器

4．2．3 实验动物

4．2．4 菌种

4．3 实验方法

4．3．1 灌胃特异性IgY对大菱鲆存活率的影晌

4．3．2 不同时间灌胃特异性IgY对大菱鲆存活率的影响

4．3．3 大菱鲆体内脏器菌数变化

4．3．4 饲喂特异性IgY对大菱鲆的预防保护作用

4．3．5 IgY对大菱鲆头肾巨噬细胞吞噬作用的影响

4．3．6 IgY对大菱鲆非特异性免疫酶学指标测定

4．3．7 统计学分析

4．4 结果与分析

4．4．1 灌胃特异性IgY对大菱鲆存活率的影响

4．4．2 不同时间灌胃特异性IgY对大菱鲆存活率的影响

4．4．3 攻毒大菱鲆体内脏器菌数变化

4．4．4 饲喂特异性IgY对大菱鲆的预防保护作用

4．4．5 IgY对大菱鲆头肾巨噬细胞吞噬作用的影响

4．3．6 IgY对大菱鲆非特异性免疫酶学指标测定

4．5 讨论

4．6 小结

结论

参考文献

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢